克服免疫印迹再现性问题:建议生产更准确和可靠的数据

免疫印迹的目标是可靠地检测和量化蛋白质表达水平。表现良好时,他们可以准确和成本效益。

但是,据Bio-Rad北美科学家的调查中,近一半报道,西方的屁股失败至少四分之一的时间。此外,十之有七人测量变化报道称,他们的研究结果没有重现(%简历> 10%)。这些结果表明,大多数科学家发现它难以准确量化他们的西方印迹和生成可靠的数据。

本文概述了关键工作流步骤帮助研究人员进行更好的西方的屁股。通过执行这些步骤的最佳实践——样品制备凝胶电泳,凝胶转移,蛋白质检测和图像分析,研究人员可以预期良好的免疫印迹数据。

第一步:优化裂解样品制备过程中是至关重要的

在样品制备过程中,科学家应该比较裂解方法方法用于打开细胞和优化裂解缓冲最大化目标蛋白质的溶解度和恢复(年代)。此外,污染和蛋白质降解需要最小化。

清洁工具和pH-neutral水会降低污染,和冷材料将减缓蛋白质降解。这意味着与冰冷的缓冲和处理组织立即或速冻和存储组织在-80°C。¹

科学家可以通过考虑优化裂解缓冲细胞蛋白质的位置。¹例如,里帕裂解缓冲优先提取核蛋白质。如果目标蛋白产量很低,科学家应该考虑分馏为low-abundance丰富蛋白质。¹

广泛的细胞破碎方法的存在。Detergent-based或enzymatic-based方法温和,适合从细胞中提取的蛋白质。更严厉的方法如声波降解法或French-pressing通常需要破坏组织。更严厉的方法、发泡应该避免,因为它可以减少蛋白质产量。¹

裂解释放蛋白酶可以影响蛋白质的稳定性。鸡尾酒添加蛋白酶抑制剂,防止蛋白降解。为达到最佳效果,裂解缓冲食谱应该根据需求调整靶蛋白(s)。最好举例来说,保护类泛素化添加isopeptidase抑制剂蛋白质,ubiquitylation,乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)和碘乙酰胺(IAA)或N-ethylmaleimide (NEM)应该被添加到裂解缓冲。¹

第二步:用正确的材料凝胶电泳

电泳分离的蛋白质中包含的细胞提取按大小。最佳分离,科学家应该考虑凝胶类型、运行的凝胶和化学缓冲区,和样品的蛋白质的总量。

凝胶类型选择基于目标蛋白质的分子大小(年代)。²与更高比例的聚丙烯酰胺凝胶(10%或以上)有较小的毛孔,可以单独的小蛋白质(< 15 kDa)。较高的蛋白质分子量应该通过与较低的聚丙烯酰胺凝胶百分数。梯度凝胶(聚丙烯酰胺增加比例从上到下)可以与广泛的单独的蛋白质分子大小。

许多类型的缓冲区用于凝胶电泳。例如,Tris-acetate凝胶和XT Tricine-based缓冲区提供最好的分离(> 250 kDa)大分子蛋白质,肽测序,或质谱的应用。Tris-HCL凝胶与三羟甲基氨基甲烷/液甘氨酸/十二烷基硫酸钠(SDS)内部缓冲区是廉价和容易准备。如果很长的保质期是可取的,TGX凝胶有一年的保质期。³

为了避免或过载下凝胶并确保准确的量化对于下游步骤,科学家应该测量样品在装货前的总蛋白凝胶。商业工具可以测量样品中总蛋白浓度。比较蛋白质含量的差异,这是最佳实践来加载样品检测的线性范围内。⁴为此,稀释系列测试来确定运行示例加载量的范围提供了一个线性比例的蛋白质凝胶的信号。

第三步:转移取决于印迹膜和转移方法

在这一步中,蛋白质从凝胶转移并使用电泳膜上。有两个重要的方面:选择印迹膜的类型和传输方法。

聚乙二烯二氟化物(PVDF)或硝化纤维膜用于免疫印迹。PVDF膜有较高的机械强度,剥离和re-probing,可以转移疏水或膜蛋白,与SDS-containing缓冲区和工作得很好,但需要在甲醇预浸泡。硝化纤维素膜有良好的信噪比和不需要甲醇预处理。然而,他们是脆弱的和SDS-containing缓冲区抑制蛋白结合。³

有几个选项转移方法:³

• 湿:最受欢迎的方法,湿转移是灵活的电压,吸水时间,冷却,和蛋白质大小。
  
• 半干:15-60传输时间的分钟和一个更简单的组装,这个方法时首选的高吞吐量和不连续缓冲系统是必要的。然而,扩展传输时间不可能是由于缓冲损耗。它与蛋白质30 - 120 kDa效果最好。
• 快速半干:这些系统完整的转让范围广泛的蛋白质大小在3分钟。他们实现这一目标通过使用专有的缓冲区和材料。⁵

为达到最佳效果,研究者应该优化传输方法和减少膜的处理。

步骤四:最大化信号具有良好的抗体实践

对于免疫印迹的成功,一个好的主要抗体必须敏感的(提供一个强烈的信号目标蛋白质)具体的(不与其他蛋白质结合)。最好的商业抗体提供性能数据在各种细胞溶解产物和推荐使用浓度,但科学家应该经验确定浓度,等待最好的结果。⁶确认主要的抗体是特定的,科学家们必须包括适当的积极的和消极的控制。积极的控制可能包括一个细胞或组织溶解产物表达目标蛋白质(年代)。二次抗体(没有初级抗体)从细胞或组织样品和样品溶解产物已知不表达目标蛋白质(s)可以消极的控制。

不同的代理可以用于屏蔽非特异性网站包括自制的配方以及商用准备。因为每个antibody-antigen交互是独一无二的,必须注意确保阻滞剂是兼容的。例如,脱脂牛奶不应使用磷蛋白质的检测,biotin-avidin /链霉亲和素或碱性磷酸酶。另一个例子,BSA抗体不建议使用创建与phosphotyrosine使用BSA-coupled肽或抗体。³

检测多个蛋白质相同的污点,常见的做法是带和reprobe或膜切成一条条,个人与不同的抗体检测。但与荧光检测,多路复用多个目标同时是可能的,可以不再需要剥离或切膜,从而节省时间和节约样品。⁷此外,多路检测可以检测蛋白质磷酸化和non-phosphorylated形式的同时,不可能当膜切成条状的东西。荧光蛋白免疫印迹还提供检测的线性范围的六个数量级的。新的荧光标签组成的聚合物纳米粒子荧光体提供一个光明的信号比传统的荧光标记抗体和提供可比对化学发光检测的敏感性。⁸

第五步:图像分析和规范化完成免疫印迹工作流

在这一步中,蛋白质的大小、数量和纯度测量。

各种各样的软件可以用于图像采集和量化的蛋白质乐队来自西方的屁股。在图像分析中,首先,科学家指定区域的污点将量化和减去背景。⁹有两种主要方法背景减法。一般来说,车道和乐队的方法提供了一种更好的控制相比,测量体积箱。背景减法后,科学家需要正常免疫印迹数据,使一个健壮的对比样品的蛋白表达水平。

标准化占不一致在样品制备过程中,凝胶加载,蛋白质含量和凝胶转移,确保检测实验条件的直接结果。¹⁰传统的辅助蛋白(HKP)归一化是一种固体的方法如果可以验证,HKPs不随实验条件,他们不习惯在饱和水平。总蛋白正常化(TPN),它使用蛋白在整个车道规范化表达水平,是一个新兴的技术,既简单又快。¹¹还有一个新的没有污点TPN方法节省更多的时间和更敏感比传统Coomassie蓝染色法。¹²

结论

西方墨点法是通常持续多日的工作流,需要几个决策和执行几个实验室正常步骤。免疫印迹数据收集好,应把重点放在优化描述每个步骤到目标蛋白(s)。从那时起,科学家应该考虑替代措施简化或自动化工作流不牺牲再现性,同时保持整体一致的方法减少可变性,增加结果的信心。

引用

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2。小贴士为应用程序选择最佳的凝胶,Bio-Rad实验室,2018年10月17日访问

3所示。最佳实践的最佳西方的污点2018年10月17日,Bioradiations访问

4所示。免疫印迹归一化方法Bioradiations,于2018年10月24日通过

5。Lin-Moshier Y -马尔尚JS。快速免疫印迹协议对非洲爪蟾蜍卵母细胞,冷泉Harb Protoc。2013 (3), doi: 10.1101 / pdb.prot072793

6。找到一个好的抗体的abc:如何找到一个好的抗体,验证,并发表有意义的数据2018年10月17日,F1000研究,访问

7所示。近藤Y, Higa年代,Iwasaki T,松本T,前原诚司K,原田,巴巴Y, Fujita M, Ohkawa Y。敏感的荧光检测免疫印迹通过合并图像,《公共科学图书馆•综合》。2018年1月19日,13 (1):e0191532。doi: 10.1371 / journal.pone.0191532。

8。荧光抗体免疫印迹2018年10月17日,Bio-Rad实验室,访问

9。特纳L,哦K。规范化的如何以及为什么西方的污点2018年10月17日,Bioradiations访问

10。新西方墨点法正常化、技188金宝搏备用术网络,于2018年10月17日通过

11。ImageLab^TM总蛋白质标准化基本教程2018年10月17日,Youtube,访问

12。Yadav G、K哦。定义新常态定量免疫印迹数据2018年10月17日,Bioradiations访问