单细胞测序的最新进展与应用
单细胞测序或单细胞基因组学技术在过去10年里发展迅速，现在已经成为生物学和生物医学科学多个领域的研究人员普遍使用的技术。这些技术为以前使用的测序方法(称为批量测序)提供了显著的优势，批量测序侧重于分析组织中细胞集合的分子特征，而不是单个细胞。
由于组织和器官是由具有独特分子谱的异质细胞类型组成的，捕获单细胞分子谱可以更深入地了解正常的生理过程以及疾病。单细胞基因组学极大地增加了我们对特定细胞类型如何在不同器官系统中分化和成熟以及病理如何影响特定细胞类型的理解。海德堡大学(University of Heidelberg)助理教授、专攻多发性硬化症的临床科学家卢卡斯·斯吉尔默(Lucas Schirmer)指出:“对影响大脑的疾病的研究尤其受益于单细胞基因组学技术。”“这是由于大脑疾病的巨大细胞异质性，很难用其他方法解决。”
近年来，单细胞测序已经超越了最广泛使用的技术的界限，如单细胞RNA测序(scRNA-seq)，现在可以在单细胞水平上分析基因组DNA、蛋白质表达和表观遗传特征。旧金山州立大学研究癌症基因组学的助理教授Nicole Salazar Velmeshev博士说:“这些不同的模式，特别是表观遗传调控，对于在癌症背景下进行分析至关重要，因为肿瘤细胞采用各种机制来逃避身体防御。”另一个最近的趋势是同时分析多个分子形态，如RNA和表观基因组，在同一个单细胞。单细胞基因组学研究的爆发离不开对单细胞进行更快、更敏感和更大规模分析的技术的发展，也离不开生物信息学分析技术的发展。在这里，我们回顾了单细胞测序最常用的技术和工作流程，并讨论了目前采用这种方法的研究。
单细胞RNA测序实验工作流程
scRNA-seq是最广泛使用的单细胞基因组学技术，旨在获得从感兴趣的样本中分离出来的单个细胞的基因表达谱。基因表达谱表明了细胞的身份和状态，因此scRNA-seq可用于确定被分析的细胞类型，以及其基因表达谱(也称为转录组)在感兴趣的条件下如何变化——例如，在特定的疾病状态下。
scRNA-seq的第一步是捕获单个细胞，对来自同一单个细胞的RNA分子进行分子条形码。在过去的10年里，已经开发了几种细胞捕获方法;主要方法包括在微流控设备的微孔中捕获细胞，使用荧光激活细胞分选(FACS)将单个细胞分选到平板的孔中，或者最近将单个细胞封装到亲脂介质中形成的水滴中。一旦单个细胞被捕获，使用逆转录(RT)从每个单个细胞的RNA分子生成互补DNA (cDNA)，同时将独特的DNA序列引入每个cDNA分子(细胞条形码)。在基于液滴的scRNA-seq中，带有细胞条形码的RT引物将二氧化硅珠与单个细胞一起包裹在液滴中，从而确保每个唯一的细胞条形码仅限于特定细胞中包含的RNA。除了细胞条形码之外，RT引物还可以用于包含第二个条形码——唯一分子标识符(UMI)——这是引物的每个DNA分子所独有的。UMIs允许定量原始RNA分子的数量，而不是cDNA，后者是优先的，因为cDNA拷贝的数量受到技术因素的影响，如PCR偏置。然后，cDNA准备用于下一代测序(NGS)，方法是将其分割，连接测序适配器并扩增。通过测序细胞条形码、UMI和cDNA中与原始RNA分子相对应的部分，可以确定每个RNA分子属于哪个单独的细胞，并量化其丰度。
其他单细胞基因组学应用的工作流程
其他单细胞测序方法的工作流程，如单细胞表观遗传学分析，通常涉及将单个细胞分选到板孔或称为组合索引的方法。组合索引使用一组两个条形码，而不是单细胞条形码，来标记源自同一单细胞的RNA或DNA，并提供单细胞分辨率，而不需要对单个细胞进行排序。一旦生物分子被条形码，它们就会根据所需的读数进行处理，例如使用单细胞ATAC测序(scATAC-seq)进行开放染色质分析的转座酶消化或用于单细胞DNA甲基化分析的亚硫酸氢盐处理。
最近开发了新的方法来分析单个细胞中的多种分子形态，如开放染色质和RNA表达。“组合分析对我们癌症生物学家特别有吸引力，因为它们为研究肿瘤细胞的类型和状态以及它们的表观遗传状态开辟了道路。一些最有效的癌症治疗是针对调节肿瘤细胞的表观遗传学状态，因此了解癌症表观遗传学对未来的治疗非常重要，”Velmeshev说。
在单细胞RNA测序工作流程中结合空间作图和基因签名确认
复杂的，高度异构的组织，如大脑，由多种细胞类型和状态组成。然而，对这些复杂组织类型的研究需要一种具有单细胞分辨率的高度敏感、特异性和多路空间方法。下载此应用程序注意发现一种技术，可以应对这些挑战，使研究人员能够同时检测多达12个RNA靶标。以及在组织背景下在单细胞水平上绘制scRNA-seq基因图谱，并定位新识别的细胞亚型和细胞标记物。
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生物信息学分析单细胞测序数据
一旦生成了scRNA-seq数据，就可以进行下游生物信息学分析。首先，原始测序读数需要与参考基因组对齐，需要检测细胞条形码，并且需要将来自同一细胞的RNA的读数(或UMIs)分配到基因并量化。这部分scRNA-seq分析是计算资源密集型的，通常在高性能计算集群上执行。存在一些免费的生物信息学管道，如dropSeqPipe，用于分析使用Drop-seq和基于板的scRNA-seq方法生成的原始数据。
原始scRNA-seq数据分析的最终结果是捕获和分析的每个细胞的每个基因的read或UMI计数矩阵。该矩阵是下游分析工具的输入，旨在识别原始样本中包含的特定细胞类型，其基因表达标记，以及在实验条件下细胞类型的转录组变化。用于单细胞基因组数据下游分析的最普遍使用的工具是软件包Seurat1和单片眼镜2．Seurat可用于对单细胞基因组数据进行无偏聚类，根据单细胞分子谱的相似程度对细胞进行分组。除了集成来自不同来源和模式的数据集(例如scRNA-seq和scATAC-seq)外，Seurat还可以用于识别结果集群的标记(通常对应于细胞类型)。Monocle用于执行所谓的伪时间分析，根据基因表达或其他模式(如ATAC-seq信号)的动态变化排列单细胞谱。伪时间分析有助于发现特定细胞类型在一段时间内发生的变化或作为连续过程的结果，如大脑发育或神经退化。重要的是，这两个软件包都可以应用于不同形式的单细胞测序数据，而不局限于scRNA-seq。
利用scRNA-seq进行大规模基因组学研究
scRNA-seq已经应用于许多生物学问题;然而，这种技术在解决神经科学领域的问题方面特别成功。这是因为哺乳动物，尤其是人类的大脑可以说是最复杂的器官，由数十到数百种不同的细胞类型组成。与免疫系统等其他器官中的细胞不同，使用流式细胞仪等传统技术很难分离出脑细胞。
scRNA-seq已被用于创建发育中的人类大脑的单细胞分子图谱，这为人类大脑发育绘制了蓝图，这对理解神经系统发育疾病至关重要。在一系列备受瞩目的研究中，一种被称为单核RNA测序(snRNA-seq)的scRNA-seq修饰已被应用于死后脑组织样本，以研究神经发育和神经退行性疾病(如自闭症谱系障碍)中特定细胞类型的分子变化3.，多发性硬化症4和阿尔茨海默病5．Schirmer是MS snRNA-seq研究的第一作者，他指出:“在MS病理方面，单核RNA-seq确实让我们大开眼界。就在五年前，我们只能在有限的几种细胞类型中研究少数基因的表达。现在，使用相同的组织，我们可以知道在MS病变进展过程中每种细胞类型中的每个基因是如何变化的。”
利用单细胞表观遗传学分析的最新研究
单细胞表观遗传分析正在迅速成为揭示组织和起源中的特定细胞类型如何发展和受疾病影响的工具。因此，scATAC-seq最近被用于研究发育中的人类大脑中细胞类型的表观遗传特征6随着他们的分化和成熟而改变。此外，scATAC-seq已被用于深入了解表观遗传调控在各种癌症(如三阴性乳腺癌)进展中的作用7．Velmeshev说:“这些新方法，包括单细胞ATAC测序和DNA甲基化，将使我们能够观察肿瘤细胞的特定克隆如何改变其表观遗传特征，以及表观遗传药物如何纠正这些变化。”
近年来，单细胞测序已成为许多生物医学研究领域的一种选择方法，因为它能够提供关于所有细胞类型和样本中数千个单个细胞的分子状态的信息。这些技术正在迅速发展，以提高其敏感性和可扩展性，并减少进行单细胞测序研究所需的价格、时间和资源。
引用:
2.曹杰，Spielmann M，邱，X等。哺乳动物器官发生的单细胞转录景观。自然．2019, 566(7745): 496 - 502。doi:10.1038 / s41586 - 019 - 0969 - x
**本文基于的研究结果是
还有待同行评议。因此，结果被认为是初步的
应该这样解释。了解同行评议的作用
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