SPR实验的注意事项

这种类型的信息不像其他只能获得端点信息的技术那样容易获得。分析是实时的，并且能够自动化，这一事实也吸引了研究人员。

在其最基本的形式中，使用该技术的想法是这样的-通过共价耦合(永久键)或通过捕获(临时键)，将目标分子连接到已经与自组装单层(SAM)或进一步到水凝胶衍生的黄金传感器芯片表面。然后，将另一半的结合对(分析物)流过表面。如果两个生物分子之间存在相互作用，则根据耦合的目标数量、所涉及分子的分子量比、目标和分析物上的结合位点数量以及注入的分析物浓度，您将看到一个特征(对于对)关联结合曲线。一旦新鲜的分析物不再供应给传感器芯片，该结合曲线将衰减(解离)。这种相互作用以折射率单位随时间的变化来实时跟踪。

虽然仪器的设置和分析可能并不总是那么简单，但可以遵循某些指针来简化方法开发过程并获得最佳数据。

方法开发

做看看你的化合物(或相关化合物)是否在文献中发表过，特别是使用SPR。如果你不确定你想要尝试的条件，这提供了一个很好的起点。

做利用您在使用其他技术研究化合物时获得的知识来帮助SPR的开发工作。特别是，了解在酸、碱或离子溶剂中的稳定性有助于确定合适的再生溶液。同样，如果你有平衡解离常数(K_D)它会让你知道你可能想要注射的浓度。

做从耦合过程的标准缓冲区开始。例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)或HEPES缓冲盐水(HBS)添加或不添加tween 20。总是使用pH值在7左右(7.4是典型的)，除非你知道你的样品在这个pH值下不稳定。

做包括观察目标物与分析物结合所需的添加剂。例如，二硫苏糖醇(DTT)，氯化镁，氯化锰，或一些其他添加剂可能需要取决于目标和分析物样品的类型。

做开始胺耦合的开发工作，除非你确定较低的pH值会使目标变性/失活，或者你在目标上有一个标签，你想用它来耦合到传感器芯片。在确定如何耦合目标时，考虑绑定口袋的位置(如果已知)。此外，如果可能的话，考虑切换绑定对的哪一半是耦合的。

做当目标物的分子量远高于分析物时，使用高容量水凝胶传感器芯片(葡聚糖是最受欢迎的，但也可以使用其他类型)。

不如果最初的实验没有按计划进行，你就会气馁。

做有一个备份计划，例如，如果直接耦合不起作用，可以尝试捕获实验。

获得最好的结果

做计划固定最少数量的目标以获得分析物注射的曲率。对于初始实验，当观察分析物分子量/目标物乘以固定目标量的比值时，目标约为50-100(假设1比1结合)。您可以稍后根据需要改进这个实验。请记住，需要在注入的关联部分的曲率，以便可以计算出最大响应来确定动力学。

做一个朗缪尔等温线，如果你在最高的注射达到平衡。计算出来的K_D平衡图的值将等于从数据的全局动力学拟合中获得的值。

做将分析物溶解在运行缓冲液中以消除体移(与结合无关的折射率变化)。如果您正在使用DMSO来组成浓缩的分析物库存，请务必在进行样品稀释时考虑到这一点，并使样品稀释剂尽可能接近运行缓冲液。通常用于小分子注射的流动缓冲液DMSO含量为1-5%。

做考虑使用温度作为变量。虽然大多数实验都在25摄氏度下进行，但使用更高或更低的温度也是一种选择。例如，较低的温度可以增加目标的稳定性，而较高的温度可以更好地模拟人体的温度。改变温度也可以让你研究热力学参数。

做使用最弱的再生解决方案，提供完整的再生(返回响应基线或更低)。从而使目标不太可能随时间变性。如果再生困难，可以考虑捕获实验。

不做一次实验并报告结果。实验必须进行多天，以确保其可重复性。

做全局拟合(将所有注射合在一起)表明反应不随浓度变化。

做重复或三次注射每种样品浓度，以显示表面(目标)不随时间而衰减。

在关闭

也许最重要的是，不要被SPR吓倒。通过遵循已开发的协议和指导方针并对其进行调整以满足您的需求，您可以最小化开发时间并最大化结果。

作者:Mary M. Murphy博士，Reichert生命科学应用科学家