理解结构生物学，它的应用和创建一个分子模型

什么是结构生物学?

结构生物学是一个致力于研究构成生命物质的分子结构的领域，包括蛋白质、核酸、脂质膜和碳水化合物。结构生物学提供的信息对于理解生物分子的功能和动力学以及它们之间的相互作用机制至关重要。¹

现代结构生物学的起源可以追溯到20世纪10年代，当时德国物理学家马克斯·冯·劳埃发现，用x射线照射的生物晶体样品产生的衍射图案取决于它们内部的原子组织。²这一发现，连同威廉和劳伦斯·布拉格的工作，标志着主要结构生物学技术之一:x射线晶体学的发展的开始。^3.这些进展使人们第一次阐明了蛋白质的结构⁴以及20世纪50年代DNA双螺旋结构的发现。⁵核磁共振(NMR)光谱学从20世纪80年代开始对结构生物学的发展做出了巨大贡献，当时科学家开始广泛应用于生物分子的研究。⁶最后，在过去的几十年里，其他技术在结构生物学中获得了突出的地位，比如小角度x射线散射(SAXS)，⁷电子顺磁共振谱⁸特别是低温电子显微镜(cryo-EM)。⁹

结构生物学提供了有关生物物质组织的信息，包括原子和分子的空间分布，生物聚合物的整体折叠，甚至生物大分子的结合以形成巨大而复杂的复合物。此外，结构生物学能够揭示分子相互作用和动态参数的细节，如分子的灵活性。

蛋白质和核酸是研究最多的生物分子，因为它们在生物体中发挥着大量不同的功能。这些职能与其结构组织密切相关。为了解决结构和功能之间的关系，结构生物学利用了一些与蛋白质和核酸的层次组装相关的基本概念(如大分子结构;一级、二级、三级和第四纪结构;结构域和母题;或者从热力学角度(蛋白质折叠和蛋白质动力学)对结构组织本身的过程进行研究。下面将解释这些概念。

高分子结构

大分子通常被认为是质量大于5000 Da的生物聚合物，是生命物质的核心组成部分。¹分子内不同原子的分布及其连通性决定了能够建立相互作用或发生化学转化的化学基团的位置。它们的位置对于大分子与其他伙伴结合或执行生物活动是必不可少的。

一级结构，二级结构，三级结构和四级结构

蛋白质是由叫做氨基酸它们由肽键连接。蛋白质中有20种不同的常见氨基酸，它们的侧链不同，因此表现出不同的物理化学性质。蛋白质一级结构由聚合物链中氨基酸的分布或顺序来定义(图1)。在蛋白质聚合物中，前一个氨基酸和后一个氨基酸之间的键形成的角称为“二面角”(分别用φ和ψ表示)。这些角度是由不同氨基酸之间建立的非共价相互作用决定的。当一个多肽序列包含一系列连续的氨基酸，显示相同的二面角时，聚合链形成规则的结构，称为蛋白质二级结构(图1)。最常见的是α-螺旋(φ = -60°;ψ = -45°)，β-股(φ = -135°;ψ = 135°)和转角(φ和ψ值可变)。蛋白质的二级结构元素与非结构化区域一起折叠形成一个被包裹的实体的方式被称为三级结构(图1)。为了发挥其功能，许多蛋白质需要通过与其他蛋白质结合形成复合物。复合体中的每个蛋白质都是一个亚基，不同亚基结合形成一个更大的、有组织的、功能实体的方式被称为四元结构(图1)。^{1，10，11，12}

核酸的结构可以按照类似的方案描述，因为它们是由磷酸二酯键连接的单体(核苷酸)组成的聚合大分子。有五种不同类型的核苷酸(腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶-仅在DNA中-和尿嘧啶-仅在RNA中)，就像蛋白质一样，核苷酸的特定序列决定了核酸的初级结构(图1)。在DNA和RNA中，二级结构元素由核苷酸之间的相互作用决定，可以是顺序的(堆叠相互作用)或非顺序的(氢键)(图1)。关于DNA，来自不同链的核苷酸之间的氢键产生螺旋结构。在RNA的情况下，二级结构最常见的元素是螺旋(也称为茎，由配对的核苷酸形成)和环(由非配对的核苷酸形成)。当两个DNA分子的核苷酸通过氢键配对时，DNA在更高的水平上组织，形成双螺旋结构。这是DNA的三级结构(图1)，它可以显示不同的构象，如A-DNA, B-DNA(主要存在于活细胞中)和Z-DNA。在DNA中观察到的其他三级结构是三重和四重螺旋(triplexes和四重螺旋)。在RNA的情况下，最常见的三级结构元素是茎环(一个碱基配对的螺旋，以一个小环结束)和假结(一个茎环中未配对的环与序列的另一个区域配对)。第四结构(图1)是核酸中更高层次的组织。对于DNA，它可以应用于与蛋白质(组蛋白)结合形成染色质。 For RNA, a typical example is the association of various RNA molecules (subunits) to form larger entities, such as the ribosome.^{1，10，11，12}

结构域

在蛋白质中，结构域被定义为由少于200个氨基酸组成的多肽链区域，当与蛋白质的其余部分分离时，通常能够保持其折叠。结构域非常紧凑，通常呈球状。根据结构域的二级结构元素，结构域可分为五类:α(只有α-螺旋)、β(只有β-链)、α/β(由α-螺旋连接的β链)、α+β(单独的螺旋和β链区域)和交联(由金属离子或二硫键稳定的二级结构元素)。^{1，10，11，12}

结构图案

在蛋白质和核酸中，二级结构可以相互组合，形成一个更紧密的结构层次(超二级结构)，其元素被称为结构基序，可以在不同的分子中找到。在蛋白质中，最常见的结构基序可分为α-排列(如螺旋-turn-helix基序)，β-排列(如β-发夹，β-曲曲，希腊键，β-桶状结构和β-螺旋结构)或αβ-包装结构(如αβ-桶状结构、Rossmann折叠结构和βαβ基序)。在核酸的情况下，结构基序被认为是三级结构元素，一些例子包括茎环、四环、十字形DNA和位移环(d -环)。^{1，10，11，12，13}

图1: 蛋白质和核酸结构的层次结构，显示最常见的结构元素的例子。资料来源:科技网188金宝搏备用络。

蛋白质折叠

蛋白质折叠是多肽链采用其功能三维分子排列(称为原生构象)的过程。这个过程以分层的方式进行，这意味着更简单的结构元素首先形成(二级结构)，然后它们相互组合，形成一个折叠核心。一旦这个核心被构建，整个蛋白质折叠就以一种合作的方式发生。在折叠过程中，许多物理化学相互作用起着关键作用，如氢键、范德华力和疏水效应。有时，被称为伴侣的特殊类型的蛋白质有助于这一过程，确保正确的蛋白质折叠。¹⁴

由于多肽的高度复杂性，折叠过程可能会很慢，因为有无数种可能的折叠方案。然而，在现实中，大多数蛋白质能够在毫秒级的时间范围内获得其功能结构。¹⁵为了解释这一事实，蛋白质折叠通常用能量景观漏斗来说明(图2)。最初，多肽折叠在能量上不占优势(它是高能量的)，但一旦链的某些区域开始采用规则构象，折叠中间体的能量就会降低。在这种情况下，多肽链通过一系列中间步骤(熔球)，逐渐减少其能量需求，使该过程在能量上更有利。在每个折叠步骤中，只有一定数量的能态是可接近的，这样，折叠过程变得越来越合作，直到达到能量最低的最终结构(原生结构)。^16，17

图2: 能量景观漏斗显示蛋白质从未折叠状态到原生状态(最低能量)的折叠过程。图片来源:Thomas Splettstoesse，转载于 创作共用署名相似共享3.0未移植许可 ．

蛋白质的形状

蛋白质的三级结构决定了它的整体形状，这与蛋白质的功能密切相关。许多科学家试图开发生物信息学工具，能够根据蛋白质的形状或整体结构对其进行分类。这些工具将有助于更好地理解蛋白质功能，并为临床或生物技术应用设计具有特定功能的新蛋白质。^{18，19，20.}

一般来说，蛋白质的整体形状可分为四类:球状蛋白、纤维蛋白、膜蛋白和内在无序蛋白(IDPs)，如图3所示。球状蛋白呈球形，具有高度的结构复杂性和多种功能。另一方面，纤维蛋白具有细长的形状，从结构角度来看相对简单，并发挥结构作用，通常构成纤维网络。膜蛋白包含能够嵌入脂质双分子层疏水核心的区域，专门用于信号转导或膜运输。最后，idp是结构水平非常低的蛋白质，因此非常动态。^{12，21，22，23，24}

图3: 自然界中发现的不同蛋白质形状的例子:A)球状(人类血红蛋白，PDB: 1SI4);B)纤维(人角蛋白，PDB: 6EC0);C)膜蛋白(人CCR5趋化因子受体，PDB: 4MBS);D)本质紊乱蛋白(human TDP43, PDB: 2N4P)。图片来源:所有结构均来自 蛋白质数据库 ，转载于 CC0 1.0通用(CC0 1.0)公共领域奉献 ．一) Sen U, Dasgupta J, Choudhury D, Datta P, Chakrabarti A, Chakrabarty SB, Chakrabarty A, Dattagupta JK, B) Eldirany SA, Lomakin IB, Bunick CG, C) Tan Q, Zhu Y, Han GW, Li J, Fenalti G, Liu H, Cherezov V, Stevens RC, GPCR网络(GPCR)， Zhao Q, Wu B，修改为包括平行线以指示膜的位置，D) Mompean M, Romano V, Pantoja-Uceda D, Stuani C, Baralle F, Buratti E, laurent DV。

蛋白质动力学

蛋白质不是坚硬的固体，而是具有不同自由度的动态大分子。在局部水平上，围绕化学键的旋转，特别是在氨基酸侧链中，是常见的，因此许多化学基团能够在蛋白质中修改它们的方向。在更高的水平上，蛋白质主干在那些结构不规则的区域(如环路或无序区域)是灵活的。这些区域的重排通常发生在与其他分子结合或环境条件发生变化时。有时，这种结构重定向导致整个蛋白质形状发生更剧烈的变化，蛋白质结构域发生显著的位移。^25，26，27

由于这些动态特征，蛋白质在生理条件下并不表现出独特的结构，而是在许多不同构象(构象)之间波动。蛋白质的动态变化对其功能至关重要，因为它们可以使它们的形状适应其他结合伙伴或受体，或在活性和非活性形式之间切换。^25，26，27

有许多技术用于解决结构生物学问题。所有这些技术都有其优点和局限性，因此，科学家通常将其中一些技术结合起来，以实现对所研究系统的更完整的描述。结构生物学中使用的主要技术有:

• 低温EM
• X射线晶体学(包括连续飞秒晶体学(SFX)和高通量晶体学(HT))
• 核磁共振光谱学
• 交联质谱(XL-MS)
• 小角度x射线散射
• 中子衍射
• 蛋白水解作用
• 圆二色性(CD)
• 电子顺磁共振谱(EPR)

要了解更多关于结构生物学中使用的技术，它们的优点和局限性，请访问下面的文章。

生物分子的结构表征经常具有挑战性。虽然有时可以建立高分辨率的分子模型，但许多生物分子显示出阻碍结构分析的特征。基于这个原因，整合结构生物学已经成为一种巧妙的方法来规避这些困难。该领域通过整合通过不同实验技术结合物理和统计方法获得的信息来解决生物分子的结构研究。^{28，29，30.，31，32}

整合结构生物学通过结合有关原子空间组织、复合物中亚基的相对配置、分子动力学和灵活性以及分子内和分子间相互作用等方面的信息，通过不同的技术获得，提供了对生物分子整体的非常完整的描述。这些信息被转化为结构约束，这些结构约束必须由通常通过计算方法建立和优化的分子模型在可接受的容忍范围内实现。这一过程被称为集成/混合(I/H)建模，并在一系列连续和迭代的步骤中执行，包括检索系统的所有可用数据，使用该信息来构建结构组件的模型，对这些模型进行评分和过滤，最后验证整个模型。^{28，29，30.，31，32}

整合结构生物学是克服使用单一技术构建生物分子详细结构描述的固有局限性的有利方法。在这方面，这种方法对于处理大型、复杂的生物分子整体的研究特别有用。使用I/H建模的一个标志性例子是酵母核孔复合体(NPC)的结构研究。NPC是包埋在核膜中的一个巨大的蛋白质集合(> 500个亚基)，是负责在细胞核和细胞质之间运输蛋白质和核酸的主要成分。由于它的大小和灵活性，不可能用独特的原子分辨率技术，如x射线晶体学或核磁共振波谱来阐明它的结构。尽管如此，通过结合x射线晶体学(孤立亚基结构)、XL-MS(距离限制)、定量质谱和定量质谱的综合方法已经解决了一个精确的模型在活的有机体内校准成像(化学计量学)和冷冻电子显微镜(整体复杂形状)。通过结合所有这些技术的信息，建立了一系列满足所施加限制的分子模型。这些模型是根据一个评分函数的值进行排名的，该函数量化了模型对约束条件的适应程度。选择得分最高的模型，因为它们与实验数据最一致，并使用计算工具对它们进行优化，在不违反任何约束的情况下对结构进行轻微的改变，以使系统能量最小化。最后，为了验证整个模型，保留一些实验数据是有用的，一旦建立了模型，就使用这些数据来检查模型是否与它们一致(图4)。^{28，29，30.，31，32}

图4: 结构确定的综合方法综述。 来源:Techn188金宝搏备用ology Networks，修改自Rout等。 ²⁹

蛋白质在每一个生物过程中都起着核心作用，执行着各种各样的功能。这些功能与它们的原生结构密切相关。因此，结构生物学的目的之一是阐明蛋白质的结构，以了解它们是如何工作的。如前所述，解决蛋白质结构是一个具有挑战性的过程，既昂贵又耗时。在这方面，日益强大的信息学工具的发展导致了该领域的扩大in-silico蛋白质结构预测。本学科的重点是利用计算方法从蛋白质的氨基酸序列推断蛋白质的3D组织。由于蛋白质呈现出等级结构，in-silico方法可以应用于预测二级、三级或第四纪结构。随着组织复杂性的增加，结构预测变得更加艰巨，也更难获得较高的精度。

有各种各样的in-silico蛋白质结构预测的方法，如二级结构预测，同源建模，蛋白质穿线，从头开始方法和人工智能方法。

• 二级结构预测(SSP):该方法利用基于机器学习、神经网络(NNs)和序列比对的算法，从氨基酸序列中预测二级结构元素(α-helices， β- chains和turns)。虽然SSP只提供二级结构元素的数量、类型和顺序位置的信息，但它是一个非常有用和快速的工具，能够达到90%左右的精度。³³下面是用于二级结构预测的一些软件实例PredictProtein，³⁴气油比³⁵而且Jpred．³⁶
  
  
• 同源建模:在这种方法中，从蛋白质的氨基酸序列预测蛋白质的结构，并使用同源蛋白质的模板结构来建立模型。该方法在序列恒等式大于50%的情况下，具有较好的准确度。同源建模受到具有显著序列同一性的同源蛋白的已解决结构的可用性的限制。同源建模工具的例子如下瑞士模式，³⁷IntFOLD³⁸而且ESyPred3D．³⁹
  
  
• 蛋白质线程:当目标蛋白中没有已解决结构的同源蛋白时，可以使用折叠种类相同的蛋白作为模板来预测其结构。这种方法是通过选择足够的蛋白质结构作为模板，并将蛋白质的每个氨基酸与这些模板对齐来实现的。评分函数允许评估每个氨基酸适合模板的程度。通过优化评分函数，根据统计标准构建模型。当目标蛋白和模板之间的序列同一性较低(< 25%)时，该方法能够产生良好的预测。蛋白质线程软件的一些例子是Phyre2⁴⁰而且I-TASSER．⁴¹
  
  
• 从头开始方法:这些方法被设计用来预测蛋白质的三级结构，仅使用其氨基酸序列作为起点。这个复杂的任务需要大量的计算工作，并且它已经用于相对较小的蛋白质。该策略包括从一些候选构象开始，并根据热力学和能量标准对它们进行过滤。为了便于预测，有时会根据先前的二级结构预测建立初始候选结构。最著名的工具用于从头开始蛋白质预测罗塞塔．⁴²
  
  
• 人工智能方法:在过去的几十年里，计算技术的日益复杂使得人工智能方法的实现和优化成为可能，特别是那些基于神经网络和深度学习的方法。这些方法从氨基酸序列出发，不需要模板，能够非常准确地预测蛋白质结构。^43，44，452018年，该计划AlphaFold提出了一种基于深度学习的预测蛋白质结构的软件，可以在短时间内以高度的准确性阐明许多具有挑战性的蛋白质结构。虽然它被认为是蛋白质结构预测领域的一个里程碑，但它也有一些局限性:它不能可靠地预测IDPs的结构;它不包括对翻译后修饰或辅助因子的预测，它只描述了蛋白质中的一种构象，而这种构象可以采用多种构象。^46，47

结构生物学研究有大量的应用和潜在的应用，让我们考虑几个关键领域。

确定药物靶点

结构生物学在药物发现领域是必不可少的，其主要目标是找到新的化合物靶向生物分子作为疾病的治疗方法。的过程基于结构信息的药物发现称为基于结构的药物发现(SBDD)。SBDD工作流程通常从识别与任何疾病发展相关的蛋白质开始。然后，对蛋白质进行表达、提取和纯化，并通过不同的物化技术进行分析，如x射线晶体学、冷冻电镜和核磁共振光谱。采用综合结构生物学方法，目标蛋白的三维结构得到了解决。接下来，在活性化合物数据库上进行筛选，包括将化合物计算对接到目标蛋白的结合位点。最后，选择与蛋白质结合位点结合更有利的化合物作为命中。这些命中将通过实验评估，以检查它们与蛋白质结合的能力在体外而且在活的有机体内(并最终阻止其功能)，以选择最佳候选人(线索)跟随药物开发过程．这些先导化合物将被轻微修改，以创造出可能表现出更好治疗特性的变体(例如改善作用、降低毒性和更好的吸收)。^{48，49，50，51，52，53，54，55}

使用SBDD方法发现的一些药物的例子是雷替曲塞(治疗艾滋病毒感染)、异烟肼(治疗结核病)和STX-0119(治疗淋巴瘤)。结构生物学的使用是非常有利的，因为目标蛋白的结构模型允许通过计算方法进行广泛的筛选，大大减少了实验成本和时间。^{48，49，50，51，52，53，54，55}

研究宿主-病原体相互作用

病原体(病毒、细菌和寄生虫)能够与宿主建立相互作用，这有助于它们在宿主生物体中感染、繁殖和生存。在分子水平上鉴定和描述宿主-病原体相互作用对于了解有多少疾病传播和发展以及最终如何治疗至关重要。在这方面，结构生物学是预测和研究宿主-病原体相互作用的一个非常强大的工具(因为它们通常涉及蛋白质-蛋白质相互作用)，并描述参与这些相互作用的生物分子的结构。^56，57，58

有各种各样的方法来解决宿主-病原体相互作用的预测，可以分为两类:基于序列和域信息和基于3D结构信息。基于序列和域信息的一些方法有:^56，57，58

• 同源方法:它们是基于在不同生物的同源蛋白中寻找已知的相互作用序列。由于病原体相互作用的蛋白质可以快速变化以适应宿主的防御，这些方法容易产生大量的假阳性。
  
  
• 域的方法:由于序列可以是可变的，一些方法使用高阶结构数据，如蛋白质结构域结构。这些结构保存在同源蛋白中，即使序列改变。
  
  
• 基于Motif和集成的方法:基序是比结构域更简单的结构特征，已被证明在宿主-病原体相互作用中至关重要。有时，这种结构信息与序列数据结合在一起，以改善预测。

对于基于3D结构信息的方法，工作流程包括搜索宿主和病原体的基因组，以找到与已知复合物相似的蛋白质，并使用现有的3D结构数据来评估潜在的相互作用。^{56，57，58．}

从一般角度来看，所有这些方法都使用了结构生物学提供的关于结构和相互作用的可用信息，作为机器学习等AI工具的输入数据。这些人工智能方法利用这些数据以及一系列训练集(给予人工智能工具的信息，以提高其做出良好预测的能力)来预测潜在的宿主-病原体相互作用网络，这些网络应通过实验分析加以验证。^56，57，58

蛋白质在健康和疾病中的聚集

蛋白质聚集是在一定条件下发生的过程，其中IDPs或错误折叠的蛋白质积累和堆叠在一起，在细胞内或细胞外介质中产生沉积物。蛋白质聚集的产物可以是无定形聚集物、低聚物或淀粉样物，最后一种是最具临床意义的。淀粉样蛋白是一种蛋白质结构，由两个紧密排列的长β薄片组成长纤维。在人类中，淀粉样纤维的存在与许多疾病的发展有关，其中一些疾病严重的神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。^59，60

目前，这些疾病没有治愈方法，不幸的是，从长远来看，它们是致命的。因此，淀粉样蛋白的结构及其形成和延伸机制一直是近几十年来许多结构生物学研究的重点。淀粉样纤维结构已经通过低分辨率和高分辨率技术进行了分析，包括CD光谱，Förster共振能量转移(FRET)，原子力显微镜(AFM)、动态光散射(DLS)、表面等离子体共振(SPR)、x射线晶体学、低温em和核磁共振波谱学。^{61，62，63，64}

所有关于淀粉样原纤维的结构信息都允许对其聚集机制进行表征，并提出不同的基于结构的治疗策略。一些治疗方法侧重于通过使用变性剂、伴侣、有机化合物或多肽来抑制聚集。其他的方法是阻断淀粉样蛋白引起致病性的途径。^{61，62，63，64}

确定病毒结构

病毒是具有感染能力的分子组合，是影响人类、动物和植物的无数疾病的罪魁祸首。由于基因组编码的蛋白质很少，病毒能够通过一种非常简单的机制在活细胞内感染和复制。它们的简单性恰恰是它们的优点之一，因为这使得它们很难被药物靶向。

病毒衣壳由蛋白质组成，可以显示出各种各样的形状和大小。了解病毒如何组装并与宿主细胞及其机制相互作用，对于开发有效的治疗方法至关重要。在这种情况下，不同的结构生物学技术被用来获得关于病毒的结构信息。

一方面，一些低分辨率技术提供了关于二级结构元素和折叠/展开动力学的数据，例如CD光谱学^65，66或者荧光光谱;⁶⁵或者亚基组装和复杂的形成，比如SAXS。⁶⁷另一方面，高分辨率技术能够在原子水平上提供进一步的结构细节。例如，质谱可用于识别蛋白质亚基及其翻译后修饰，以及病毒衣壳的化学计量学。⁶⁸另外，病毒衣壳的完整结构可以通过固态核磁共振波谱来阐明，^69，70x射线晶体学⁷¹尤其是低温电子显微镜。⁷²

关于病毒及其成分的结构信息已被用于发现新的抗病毒药物和寻找现有药物的潜在重新利用机会。抗病毒药物发现遵循的策略是经典的SBDD方法，但在这种情况下，目标蛋白是病毒表达的蛋白质。^73，74，75

制作分子模型

结构生物学关注的是通过使用大量的物理化学技术来寻找有关生物分子结构特征的信息。综合使用来自不同技术的实验数据可以构建分子模型。这些模型是在一定公差范围内与实验结果相匹配的结构。为分子建模提供实验数据的物理化学技术与帮助整合所有信息并优化模型以达到最高精度的计算工具(包括人工智能资源)同样重要。^{76，77，78，79}

分子模型的重要性源于这样一个事实，即它们对于理解生物分子如何组织、它们的动力学以及它们与其他分子相互作用的能力非常有用。这些信息不仅与基础科学有关，而且与其在医学、药理学或生物技术领域的应用有关。^{76，77，78，79}

建立生物分子的精确分子模型是一项艰巨的任务，既昂贵又费时。出于这个原因，科学家们创建了专门的公共数据库，可以在互联网上访问，在那里他们保存了解决的结构。在这方面，最重要的数据库是蛋白质数据库(PDB),⁸⁰在这里可以找到和下载数千种不同技术阐明的肽和蛋白质结构，以及所有可用的信息。核酸也有类似的数据库(NDB）⁸¹碳水化合物(CSDB）.⁸²

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