Western Blot程序、分析和目的

您可能需要确定样品中给定蛋白质的存在(或不存在)和大小的原因有很多。无论是检测或调查疾病，确定基因操作实验的成功或失败，还是识别食品样本中是否存在潜在的过敏性蛋白质。为了精确定位你的目标蛋白，你通常需要将它从许多其他的背景中区分出来，其中一些可能具有相似的属性或大小。western blot就是一种提供这些能力的技术。

在这篇文章中，我们讨论了什么是western blots，它们是如何进行的，它们向我们展示了什么，以及它们与相关技术有何不同。

什么是西方污点?

western blot，有时也被称为蛋白质免疫印迹，是一种基于抗体的技术，用于检测样品中特定蛋白质的存在、大小和丰度。这项技术是在1979年发展起来的¹由哈里·托宾和他的同事提出，后来由于该技术与南方印迹法相似，被命名为“西方印迹法”。²

简单地说，水样中的蛋白质是通过电泳分离的。将样品转移到合适的膜上后，使用目标特异性抗体对样品进行探测。这些抗体可以被检测到，结合蛋白的大小和丰度可以与已知的标准或对照进行评估。

Western blot方案

图1显示了western blot方案的概述。^3.，4

图1: western blot方案概述。

Western blot凝胶

在进行western blot之前，必须分离样品中的蛋白质。这通常是通过蛋白质电泳来实现的，例如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或天然PAGE它根据蛋白质的分子量或电荷来分离蛋白质。所选择的具体分离方法将取决于分析的目的。为了获得干净的图像，将样品离心以去除任何固体，以便仅加载可溶部分。如果您感兴趣的蛋白质是不溶性部分(例如，细胞膜结合蛋白)，请先研究预处理方法以释放和溶解它。固体会损害凝胶的运行，你感兴趣的蛋白质很可能会留在堆积凝胶中。

同样重要的是，加载适当的对照样本和大小标记梯子，以便解释最终的印迹。

western blot加载控制

这是必要的，特别是当试图比较不同样品之间的蛋白质表达时知道装载了多少样品因为这可能不明显从印迹单独。例如，当评估一个污点时，一个样本的条带可能会比另一个样本亮两倍。这可能意味着样本中目标蛋白的含量是原来的两倍，也可能意味着更多的样本或一条车道上装载的样品浓度比另一条车道高。复制蛋白凝胶并用考马斯氏染色进行显影⁵可以帮助消除这种不确定性，因为它将显示总蛋白质的量⁶在每个样本车道，可以显示任何加载不一致。检测一种普遍存在的蛋白质的表达，这种蛋白质应该在所有样品之间均匀存在，例如全细胞和细胞质样品中的肌动蛋白，也可以用作负载控制，有助于确保蛋白质样品一致地转移到膜上。然而，当比较“控制”蛋白表达不同的模型(如退化模型)时，这种类型的控制可能会出现问题。^6，7

蛋白转移(印迹)

蛋白质必须从蛋白质凝胶转移到合适的膜上(通常是硝基或聚偏二氟乙烯(PVDF))，以方便抗体探测。许多技术可用于转移，包括毛细管转移，扩散转移和真空吸水，但由于其速度和效率，到目前为止最常见的是electroblotting⁸(也称为电洗脱或电泳转移)。在这里，蛋白质凝胶被夹在传递膜上，并施加电流。凝胶中的蛋白质被携带并紧紧附着在膜上。

在电印迹中，也有多种转移策略，称为湿转移，半干转移和干转移。湿转移是有效的，并提供灵活的缓冲，但耗时。半干转移是更快，仍然提供灵活性，但效率低于湿转移大蛋白质。干转移是高效和快速的，但提供的灵活性不如其他方法。

在使用可去除染色剂(如Ponceau S)进行探测之前，可以评估转移效率。

Western blot阻断

由于印迹膜对蛋白质的高亲和力，在转移后阻断任何剩余的结合位点以防止随后的非特异性结合检测抗体是很重要的。这是通过将膜与蛋白质液体(如牛奶或血清)孵育来实现的。

蛋白印迹洗涤

阻断后，重要的是在每个步骤之间清洗膜以去除多余或未结合的试剂。洗涤不充分或不均匀会导致质量差/斑点和高背景。然而，过度洗涤会减少目标信号，因此优化洗涤步骤的数量和持续时间是很重要的。确保膜被适当的缓冲液覆盖，轻轻地搅拌，均匀地清洗膜，不要损坏它。常用的缓冲液包括三磷酸盐缓冲盐水(TBS)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)，通常包含Tween 20 (TBST和PBST)。

Western blot抗体

虽然可以使用直接检测(识别目标并可检测的单个抗体)进行western blot，但更常用的是间接方法(图2)。这里，一抗用于探测膜并结合存在的任何目标蛋白。然后，使用一种结合一抗并可检测到的二抗。和所有步骤一样，优化，⁹在这种情况下选择“正确的”抗体并确定最佳浓度是做好污点的关键。

图2: 直接与间接western blot，使用的例子显示化学发光检测。

Western blot二抗

当使用间接检测分析时，需要在将多余的未结合的一抗从膜上洗掉后应用二抗。二抗应特异性于一抗的种类(例如，如果一抗来源于兔子，则为小鼠抗兔)，并具有所选检测方法所需的偶联物。

Western blot分析

有很多检测方法以及随后的western blots可视化，包括比色、化学发光、荧光和放射性检测，总结于图3。

图3: 使用间接方法进行比色、化学发光、放射性和荧光检测的例子。

这两个比色和化学发光检测需要将酶偶联到检测抗体上，被认为是非常敏感的技术。辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)是最常用的酶，辣根过氧化物酶(HRP)因其稳定性好、易于偶联且成本低而受到青睐。在检测过程中，将底物添加到膜上，由缀合酶作用，引起化学变化。如果进行比色检测，则选择显色底物，该底物将产生可以直接可视化和成像的变化。然而，及时成像的污点是重要的，因为颜色会褪色的污点干。在化学发光检测中，¹⁰产生的信号只持续到酶和底物之间的反应发生时(通常为1-24小时)。在此期间，可以通过曝光x射线胶片或使用数字成像来记录信号，以形成永久记录。

在荧光检测时，检测抗体与荧光基团偶联而不是与酶偶联。当特定波长的光照射在它们身上时，它们被激发并发出不同波长的光。然后，可以使用雪崩光电二极管(APD)、光电倍增管(PMT)或电荷耦合器件(CCD)相机等数字成像仪直观地捕捉到这一点。虽然需要专门的设备来进行激发和检测步骤，但在荧光检测中没有衬底步骤，缩短了协议。它也可以多重荧光团¹¹在western blot检测中。

放射性检测，其中放射性同位素与检测抗体结合，并在x射线胶片上检测发射的辐射，在过去被广泛使用。然而，该技术需要特殊处理以保护人员免受辐射，价格昂贵，并且由于放射性衰变而具有有限的保质期。因此，该技术大多被其他可用的检测方法所取代。

Western blot剥离缓冲液

剥离是从western blot膜上去除一抗和二抗的过程。如果您希望在一个特定的印迹上研究多个目标蛋白，而不是运行多个印迹，例如样品非常有价值或稀缺，这可能会有所帮助。

请注意，剥离也可能从膜上去除一些蛋白质，因此不能在剥离前后进行定量比较，也不应在剥离的膜上检查蛋白质的缺失。

PVDF膜¹²如果你打算剥离你的印迹，建议它们在剥离后比硝化纤维素更好地保留蛋白质。比色检测¹³也留下永久的污渍，所以化学发光检测是赞成这种应用。

如果可能的话，从温和的剥离缓冲液开始，以低pH值剥离，以尽量减少样品损失，只有在不成功的情况下才尝试通过洗涤剂或加热进行更严格的剥离。

Western blot结果及定量分析

当使用x射线胶片获得western blot实验结果时，通常需要多次曝光以优化曝光和显影时间。如果长度不够长，样品带可能会很微弱或根本看不见。太长，背景信号变得太强，波段合并在一起，产生的斑点非常暗，难以解释。控制或大小标记的浓度与目标不平衡也可能是有问题的，在另一个充分可见之前，一个会过度曝光。然后，胶片可能会被数字化，以便使用分析软件进行进一步的审讯。^14，15

利用x射线胶片的检测方法被认为是定性的或半定量的。将样品通道中的条带与对照和尺寸标记进行比较可以帮助确定样品中是否存在目标。然而，如果量化¹⁶例如，基于CCD相机的数字成像设备提供了更好的选择，因为它们具有更大的动态范围，更高的灵敏度和更高的分辨率。曝光时间可以微调，而不需要重复耗时的x射线胶片曝光和显影，优化信噪比。这可以很容易地输入到可以分析的软件中¹⁷然后比较数据。

免疫印迹诊断

有很多机会在western blot协议中，我们强调了一些出错的地方常见问题并提供可能的解决方案．^18，19

• 凝胶上蛋白条带分离不足/定位不佳(随后印迹)-优化蛋白质凝胶百分比和运行时间，以满足您的目标。
• 你身上什么也没有，连梯子也没有-确保印迹试剂盒以正确的顺序放在一起，并且电流方向正确，否则您的样品将被印迹到缓冲液中。
• 斑点看起来凌乱/有斑点-在设置转移时，确保凝胶和膜之间没有气泡。在孵育和洗涤过程中，确保膜完全浸没并轻轻混合，以产生均匀的结果。使用新鲜的堵塞试剂。
• 高的背景-堵塞或清洗可能不够。
• 对照样本的结果与预期结果不一致-优化抗体选择/浓度，以减少非特异性/脱靶结合。检查你的实验假设和概念。你的期望是否不正确?
• 在最后的污点上很难看到带子(太暗或太亮)-优化检测阶段的显影时间，以增加或减少信号强度。如果手带显得太轻，也可能表明洗过了。优化抗体浓度和考虑抗体的选择也可能有所帮助。
  
  

南方斑点和西方斑点的区别是什么?

western blot是用来检测特定蛋白质的，而Southern blot是用来检测特定蛋白质的，²1975年发明，以其发明者埃德温·萨森的名字命名，^20.用于检测特定的DNA序列。与western blot一样，样品通过电泳分离并转移到膜上。然而，与您希望检测的区域互补的DNA片段在检测之前用于探测膜。

北方斑点和西方斑点的区别是什么?

北部的印迹,²1977年由詹姆斯·阿尔文、大卫·肯普和乔治·斯塔克开发，²¹用于检测特定的mRNA序列。与western blotting和Southern blotting一样，进行northern blotting的样品通过电泳分离并转移到膜上。与目标区域互补的cDNA片段在检测前用作探针。

western blot和SDS-PAGE有什么区别?

sds - page是一种电泳技术，用于根据蛋白质的分子质量分离蛋白质，而western blot是检测特定蛋白质存在所需的整个过程。SDS-PAGE通常是在western blot方案中选择的电泳技术，作为在印迹之前分离样品中所有蛋白质的手段。

Western blot的目的

检测样品中目标蛋白的存在、大小和丰度可能是可取的原因有很多，这些原因可以跨越众多科学学科。除了目标的存在与否，该技术还可以评估:²²

• Protein-DNA交互DNA结合蛋白附着在特定DNA序列上对转录调控过程至关重要。西南部的印迹²³(类似于western blotting，除了膜上有DNA探针)可用于鉴定转录因子²⁴在基因调控研究中。
  
  
• 蛋白质相互作用-这些对许多基本的细胞过程至关重要。蛋白质相互作用的检测，使用一种被称为偏远的印迹，^25，26可以帮助阐明细胞功能和功能障碍。
  
  
• 转录后修饰(铝)- PTM影响蛋白质折叠及其功能，扩大蛋白质组多样性。然而，异常的PTM与疾病有关。因此，他们的研究引起了研究人员的极大兴趣，而western blot提供了一种这样的工具。
  
  
• 蛋白异构体检测蛋白质在不同的细胞状态下以不同的同工异构体表达，具有不同的活性或靶标。或者，它们可能需要裂解才能被激活。
  
  
• 抗体特征-当抗体作为工具或治疗药物生产时，其验证和表征²⁷对于确保正确的性能和安全至关重要。作为一种基于抗体的方法，western blotting在这一过程中是有用的技术。
  
  
• 抗原决定基映射-了解抗体如何以及在何处与目标蛋白结合对研究、诊断和治疗有价值。有许多工具用于实现这一目标，由于其特异性，western blotting²⁸就是其中之一。
  
  
• 亚细胞蛋白定位-对不同细胞组分进行western blot分析，确定细胞中目标蛋白的位置。单细胞免疫印迹法²⁹在这一领域提供了很好的见解，并克服了其他单细胞测定所经历的一些抗体交叉反应性问题。

下面将讨论一些常见的应用程序。

确定是否有蛋白表达

评估基因组数据可以告诉你，有问题的生物体是否有潜在的产生某种蛋白质。看看转录组就能知道这个基因是否打开，但除非你能检测到蛋白质你可以判断它是否被积极地表达出来。^30.在进行实验性基因组操作时，这对于确定基因组水平上的变化是否反映在蛋白质水平上的预期变化非常有帮助³¹(例如，新蛋白的表达，与野生型菌株相比的表达截断或缺失，它是否在预期的组织或位置表达?)

检测标记蛋白

在进行遗传操作时，可以设计和添加标记，例如His-tag和GST-tag。³²这使得它们附着的蛋白质很容易被找到³³在被研究的物种或系统的样本中，提供有关所研究蛋白质的位置和命运的信息。例如，是在一定条件下从细胞膜上切割出来的膜蛋白。这在检查实验产生的重组蛋白时也很有用。³⁴

映射随时间或组之间的变化而变化

时间过程实验样品的Western blotting可以提供蛋白质水平随时间变化的信息，例如在不同的细胞周期阶段。同样，在比较来自不同疾病或治疗组的样本时，它可以突出显示蛋白质水平上的变化，这些变化可能表明疾病的潜在原因或影响治疗效果。

总的来说，与PCR相比，western blotting不被认为是一种特别的定量技术。然而，它提供的直接检测蛋白质意味着它在确诊性疾病诊断中有很大的用处。

非传染性疾病的生物标志物

不同的蛋白质异构体可以作为病理过程的生物学标记，例如在癌症中。³⁵自身抗体，表明自身免疫性疾病，也可以检测到。而质谱分析通常用于它们的检测，基于抗体的技术，如western blot，仍然用于确认³⁶高通量方法的发现。

传染病诊断

Western blot已被用于确认疾病的病例，如人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒),³⁷莱姆病，^38，39牛海绵状脑病(疯牛病)⁴⁰和曲霉病。⁴¹但是，与诸如聚合酶链反应在许多情况下已经被替代的分析方法所取代，包括艾滋病毒测试。

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