ddPCR与RT-qPCR——的结果!
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最近出版的一篇论文在《病毒学方法是第一个直接比较ddPCR技术与多路复用RT-qPCR化验使用相同的反应混合和自行车等协议,所有变量都保持不变,除了平台(实时PCR或数字PCR)。研究发现,Bio-Rad滴数字PCR (ddPCR™)技术确定突变的病毒RNA在临床样本与更大的精度,灵敏度,和再现性比定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR),
讨论这项工作的意义我们采访了肖恩·泰勒Bio-Rad应用科学家和论文的第一作者。
尚恩:液滴的主要好处数字PCR (ddPCR)包括:
1)消除Cq值,因此要求效率(90%和110%之间根据MIQE指南)PCR反应。因此,样本的有害影响污染物在聚合酶的效率,由此产生的文化价值观和qPCR数据大大减少与液滴数字PCR允许从理想样本生成高质量的数据。qPCR,解决方案是稀释的样本线性内定量引物验证标准曲线的动态范围。然而,对于低表达目标,微RNA和珍贵的样本非常少量的DNA提取,稀释不是一个现实的选择,和ddPCR技术是符合逻辑的选择从污染物减少数据可变性。
2)绝对量化。ddPCR技术标准曲线不需要量化的DNA / RNA样本而qPCR他们不仅需要,而且实验室尝试绝对量化误差的主要来源,这种技术。
3)样本独立分析和数据处理。滴数字PCR给有意义的、可再生的和从每个样本定量数据,大大减少了内部和inter-assay可变性,我们展示了在我们的文章。However, 为 qPCR 之间 存在 着 相互 依存 Cq 值 样本 (to 生成 Cq’s) 或 标准 曲线 , 需要 为 每个 目标 从 单一 数据 分析 对 所有 samples. 板Interplate可变性可以消除qPCR数据的统计学意义尤其是小样本之间的差异是测量的情况。
此外,动态研究要求样本在不同时间点集合,ddPCR技术允许单个样本的即时处理时可用在不损害数据或结论。这可能是特别重要的植物、动物、病人或环境研究,需要研究集合在几个月或几年,初始数据可以帮助将实验设计。而且,由于临床诊断常常是动态的,需要连续的数据样本测量决策改变治疗方案,独立样本ddPCR技术提供了一个优秀的解决方案就像病毒样品测试我们的纸。
4)增加了变异丰富分析灵敏度。检测DNA从肿瘤生物标志物或传染病的背景/正常野生型序列与qPCR是具有挑战性的,因为罕见的生物标志物是由高水平的蒙面的背景丰富序列提供虚假负面数据低于约10%。这将是类似于众所周知的干草堆中找到一根针。因为ddPCR技术将一个给定的样本为大约20000的分区,像创造了成千上万的小干草堆中针更容易发现,大部分的背景从生物标记序列将被过滤。这允许特定于分区的放大和检测水平约0.02%的在一个。
为什么这些好处可能流感菌株耐药的重要管理?
尚恩:
在流感病毒耐药的情况下,所有这些好处变得重要,因为大量的不同病毒株必须从非常高的监控与高水平的精度很低,重现性和信心。通过消除Cq价值观和减少效率依赖,更多的样本与背景污染物可以用滴数字PCR检测给更高的信号噪声在评估残余感染治疗后更准确地评估病人复苏。
绝对浓度数据不要求每个连续的样本标准曲线保证可靠的结果,因为在感染作出可靠的治疗决定。qPCR,这将需要运行一个标准曲线在不同的板块与每个收集的样品不仅增加了重要的运营成本,而且会导致inter-assay可变性大,不准确的数据和糟糕的治疗决策。
因为这项研究不仅需要量化的病毒载量还具体丰富的突变(H275Y)与野生型病毒,ddPCR技术的独特能力划分的野生型病毒突变株给了更精确的和敏感的残余病毒的检测。这使适当的选择抗病毒治疗的感染,消除疾病。
其他应用程序可以ddPCR系统是用于在病毒学领域的?
尚恩:
除了适合监测残余感染,液滴数字PCR获得牵引病毒学市场作为基因治疗产品的质量控制方法。去年在人类基因治疗方法,伯麦等人证明了液滴数字PCR的优势作为这样一个工具和得出结论,ddPCR技术可能是有利的滴定通常用于基因治疗的病毒载体。
滴数字PCR也有用商用qPCR的评价标准。去年在《临床微生物学,例如,海登等人用ddPCR技术测试一些商业化生产二级标准基于国际标准的第一个人类巨细胞病毒(CMV),这是旨在提高量化巨细胞病毒PCR实验室之间的协议执行。数字的使用PCR作为参考方法证明缺乏定量的协议在市场上不同的二级标准。由于定量标准生产的具有挑战性的性质,一些制造商的标准采用了液滴数字PCR来帮助更好的标准开发。
你看过增加兴趣ddPCR病毒学技术诊断以来发表你的研究?
尚恩:
有不断增加的兴趣滴数字PCR病毒学领域的。病毒载量测量已经成为许多病人常规标准,特别是那些免疫系统。ddPCR提供的sample-independent分析和数据处理技术提供了一个很好的解决方案成规许多治疗方案和评估患者的复苏。
肖恩·泰勒说杰克陆克文,编辑技术网络188金宝搏备用
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