生物反应器中干细胞培养的改进

培养优质细胞是再生医学创新方法的关键要求。搅拌槽生物反应器是培养和分化人类诱导多能干细胞(hiPSCs)的有前途的培养系统，因为它们有能力产生高细胞数量，允许扩大规模，以及改善生长参数控制的前沿机会。增加细胞密度是干细胞生物处理研究的重要组成部分。

在这次采访中，塞巴斯蒂安selzEppendorf生物过程中心的战略投资组合经理bioprocess谈到了搅拌槽生物反应器中细胞培养的优势。Robert Zweigerdt博士德国汉诺威医学院的教授解释了他的团队是如何达到每毫升3500万个hiPSCs的培养产量的。

Eppendorf:治疗应用需要大量的细胞，因此需要大量的培养。与平板和烧瓶相比，搅拌槽生物反应器中3D培养的优势是什么?

Sebastian selz:搅拌槽生物反应器是目前生物制药制造的金标准。有非常成熟的，研究人员可以从大量的文献中获益。生物反应器允许创建一个受控的环境，为细胞生长或分化提供最佳条件。监管部门批准需要识别关键工艺参数和定义关键质量属性。此外，搅拌槽生物反应器的可扩展性简化了从小规模到大规模的过渡。我认为减少体力劳动是最大的优势之一。这越来越多地消除了人为错误，这对安全的治疗至关重要。

埃彭多夫:从静态培养到搅拌培养有多容易?如何进行优化?

塞巴斯蒂安selz：您需要了解您的流程，以便能够遵循设计质量原则，而不仅仅依赖于测试产品的质量。小规模模型应该是您的首要任务。从简单开始，例如在非常小的体积中测试细胞在3D中的表现。作为第一步，您可以在文献中确定合适的工艺参数，我们建议您遵循供应商的建议，并在迭代中查看您的细胞的行为。例如，我们在MH汉诺威的客户就是这么做的。他们从2D静态培养开始，然后转移到生物反应器，并使用经典的工艺开发方法优化工艺。他们应用灌注、介质交换、pH控制、DO控制等技术和方法，对一个又一个参数进行优化。最后，他们有了一个很好的工作流程。然后你要把它放大，让细胞的环境保持不变。为了实现这一点，在小范围内确定关键的工艺参数是很重要的。 We strongly advise taking a systematic process development approach.

埃普多夫:罗伯特，你的团队在搅拌槽生物反应器中培养hiPSCs作为细胞聚合体方面已经建立了专业知识。在您最新的出版物中，您报告了实现了每毫升3500万个细胞的细胞密度。这是一个巨大的飞跃!为了达到这个里程碑，你必须克服哪些主要障碍?

罗伯特。Zweigerdt:我们十年前攻克的第一个障碍是支持hiPSC种子在三维(3D)无基质悬浮培养中存活和增殖，而不是在传统培养皿和平台上采用二维依赖基质的单层培养。^1、2

第二步是采用改进的搅拌叶轮设计，支持更均匀的hiPSC聚合^3.以及随后的“保留过滤”系统。这种保留系统使hPS细胞(在搅拌悬浮培养中形成多细胞聚集体)在自动灌注喂料(定义为不断更换新鲜介质)的生物反应器中保持。⁴随后，灌注喂养是我们进行最新步骤的前提条件:即确定pH依赖性、葡萄糖消耗和乳酸积累等生长限制参数。在确定了这些限制生长的瓶颈后，进行了基于反馈的监测，这需要通过灌注喂料来控制整体介质吞吐量。我们系的Felix Manstein博士，近年来一直在推动这些研究，也实施了在网上过程建模和优化策略，为高密度生物处理hiPSCs的合理工艺开发提供依据。⁵

Eppendorf:为了在高级治疗中有前景的应用，hiPSCs需要分化成所需的细胞类型。将为单层培养设计的分化方案转化为生物反应器中的细胞聚集物有多简单?

罗伯特。Zweigerdt：几年前，在第一次成功的hiPSC 3D培养后不久，我们开始在悬浮中开发谱系特异性分化策略，⁶我们在这一领域也建立了相当程度的能力。悬浮培养中定向分化最重要的挑战包括细胞聚集物大小的影响，其异质性，整体细胞密度和定义机械和流体动力学参数。⁷

然而，我们也注意到，我们正在应用的标准培养基成分和分化导向分子，例如用于中胚层诱导和心脏分化的WNT途径调节剂，在2D和3D中具有等效的效果。⁸因此，从通常用于细胞分化基础研究的二维悬浮培养过程过渡到三维悬浮培养过程通常是直接的。然而，我们相信，在未来许多差异化战略将受益于先进的过程控制能力的生物反应器技术，仍处于发展的早期阶段。⁹

值得注意的是，我们证明了基于搅拌槽生物反应器的hiPSC分化不仅有效地适用于心脏衍射(如上文中所强调的)，而且还适用于许多其他功能性hiPSC子代的分化和产生，包括内皮细胞。¹⁰巨噬细胞¹¹以及内胚层衍生物。¹²

埃彭多夫:在上游生物加工过程中，喂养策略强烈影响细胞的生长和活力。重复批处理和灌注是去除副产物和补充营养的两种选择。你认为这两种策略的优点和缺点是什么?

罗伯特。Zweigerdt：如上所述，我们的经验表明，灌注喂养尽管复杂，但是高级hPSC培养的最佳策略。¹³这是由于快速生长的hPSC的高度糖酵解代谢，一方面，这需要大量额外的葡萄糖供应，以避免生长受限的饥饿。此外，另一方面，高糖补充导致分泌乳酸的大量积累，这可能成为有毒的，并导致培养物的增殖抑制酸化。这些问题随着细胞密度的指数级增长而呈指数级增长。⁵基于这些原因，我们认为，如果该方案的目标是优化hiPSC的高密度培养，那么灌注喂养是控制生长限制参数的最成功的策略。值得注意的是，在细胞密度增加10倍的同时，生成给定数量的细胞所需的培养基量减少了70%，这是工艺优化步骤的结果。

埃彭多夫:几年之内，你们就将hiPSC培养密度提高了十倍以上。你是如何优化你的过程来获得这个值的?

罗伯特。Zweigerdt：几年前，我们在每毫升接种50万个细胞后，每毫升获得了285万个hiPSCs，最近，我们在类似的接种密度下获得了10倍以上的细胞密度。我们遵循循序渐进的策略，系统地分析挑战，然后应用生物反应器支持的参数组合控制，从而克服限制增长的障碍。具体瓶颈包括:促进hiPSC在单细胞工艺接种后高效存活和聚集，适当调整搅拌速度以确保hiPSC不结块，将骨料直径减小到~300µm以下。其次，避免pH降至约6.7以下，确保持续的葡萄糖供应以避免细胞饥饿，调整灌注速度(从而促进最佳培养基吞吐量)以避免乳酸盐峰值积累和毒性渗透压水平以及其他几个参数。⁵然而，一旦识别出这些限制，就可以通过生物过程控制软件系统地控制它们，并结合优化在网上流程建模;我们最新的协议细节。¹⁴

埃彭多夫:你能够在150毫升的体积内产生52.5亿个hiPSCs。这个数字与细胞治疗应用(例如心脏)所需的细胞数量相比如何?你认为未来有扩大规模的必要吗?

罗伯特。Zweigerdt：尽管未分化的多能hiPSCs的生物处理取得了重大进展，但我们仍在进一步提高细胞密度，从而提高分化细胞的产量，包括hiPSCs来源的心肌细胞。虽然我们已经实现了非常高的谱系纯度，例如>95% ipsc -心肌细胞，但从分化方案获得的细胞密度仍然相对较低;目前约1-2x10⁶每毫升细胞数。⁸由于估计表明替换疾病耗尽的心肌细胞约为1-2x10⁹每个患者都需要ipsc -心肌细胞，我们目前需要大约1升的培养来为每个患者提供合适的细胞剂量。再生医学研究人员正在讨论为异体-非患者特异性-移植方法生成大量细胞的可能性，因此我们认为在未来进行大规模的项目是合适的。这一目标将是5倍、10倍、20倍、100倍，最终甚至更高的水平。

从商业角度来看，这种升级策略也非常有吸引力，其中包括过渡到完全受控的gmp条件，以符合法规要求和临床翻译。

另一种有前途的方法是“血细胞培养”，例如从hiPSC分化功能性巨噬细胞。正如我们最近在汉诺威医学院校园与Nico Lachmann小组合作证明的那样，与批量生产hipsc -心肌细胞相比，这种方法与在搅拌槽生物反应器中持续几周甚至几个月的巨噬细胞生产相容。¹¹

埃彭多夫:考虑到电池的密度，你认为还有改进的空间吗?限制因素是什么?

罗伯特。Zweigerdt：如上所述，我们认为分化hiPSC子代的生物处理有改进的空间。与多能状态下hiPSC的扩增相比，分化的(限制)因素更加复杂。其原因包括分化过程的较高复杂性，因为细胞不断改变其祖细胞状态和表型，从而改变其生理和增殖特性。我们正在努力开发表达众多不同血统的特定工艺条件。

这是一个具有挑战性的任务，但因此鼓舞人心和令人兴奋!

参考文献

1.张晓明，李志刚，张志刚，张志刚。人胚胎干细胞悬浮培养的研究进展。干细胞测定．2010; 4(3): 165 - 179。doi:10.1016 / j.scr.2010.03.001

2.张志伟，李志刚，张志刚，张志刚，张志刚。人多能干细胞悬浮培养的研究进展。Nat Protoc．2011; 6(5): 689 - 700。doi:10.1038 / nprot.2011.318

3.李志强，李志强，等。在可控搅拌生物反应器中悬浮培养人多能干细胞。组织工程C部分:方法。2012;18(10):772-784。doi:10.1089 / ten.tec.2011.0717

4.克鲁普C, Kempf H, Halloin C，等。喂养策略对一次性搅拌槽生物反应器中人类多能干细胞可扩展的影响。干细胞转化医学．2016; 5(10): 1289 - 1301。doi:10.5966 / sctm.2015 - 0253

5.王晓明，王晓明，王晓明，等。高密度生物处理人体多能干细胞的代谢控制和在硅建模。干细胞转化医学．2021; 10(7): 1063 - 1080。doi:10.1002 / sctm.20 - 0453

6.王志强，王志强，等。在可伸缩悬浮培养中控制人多能干细胞的扩张和心肌分化。干细胞代表．杂志2014;3(6):1132 - 1146。doi:10.1016 / j.stemcr.2014.09.017

7.刘志刚，张志刚，张志刚。人多能干细胞体外分化的研究进展。Nat Protoc．2015; 10(9): 1345 - 1361。doi:10.1038 / nprot.2015.089

8.Halloin C, Schwanke K, Löbel W，等。连续的wnt控制使先进的hpsc心脏处理和预后表面标志物鉴定化学定义悬浮培养。干细胞代表．2019; 13(2): 366 - 379。doi:10.1016 / j.stemcr.2019.06.004

9.Williams B, Löbel W, Finklea F，等。多因子过程模型预测人诱导多能干细胞心脏分化结果。Front Bioeng生物科技．2020; 8:851。doi:10.3389 / fbioe.2020.00851

10.李国强，李国强，等。人多能干细胞在可伸缩悬浮培养中向功能内皮细胞的分化。干细胞代表．2018; 10(5): 1657 - 1672。doi:10.1016 / j.stemcr.2018.03.017

11.李文杰，李志强，李志强，等。基于生物反应器的人类ipsc来源巨噬细胞的大规模生产使免疫疗法能够对抗细菌气道感染。Nat Commun．2018; 9(1): 5088。doi:10.1038 / s41467 - 018 - 07570 - 7

12.张志强，张志强，张志强，等。化学定义，无异种，可扩展生产的hpsc衍生的具有多谱系分化潜力的最终内胚层聚集物。细胞．2019; 8(12): 1571。doi:10.3390 / cells8121571

13.张志刚，张志刚，张志刚。人类多能干细胞大规模扩增的研究进展与挑战。学生物化学过程．2017; 59:244 - 254。doi:10.1016 / j.procbio.2016.09.032

14.Manstein F, Ullmann K, Triebert W, Zweigerdt R.在搅拌槽生物反应器中实现高密度培养人类多能干细胞的过程控制和硅建模策略。明星的协议．2021; 2(4): 100988。doi:10.1016 / j.xpro.2021.100988