应用程序的动态光散射(DLS)蛋白质治疗配方:原则、测量和分析- 3所示。DLS反褶积算法|莫尔文Panalytical

基本类型的DLS反褶积算法用于提取强度加权的粒度分布测量相关图。

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执行概要

动态光散射(DLS)是一种分析技术用于测量蛋白质配方在低聚物的粒度分布和亚微米大小范围约1海里µm 1。DLS在生物制药行业的流行是它的结果工作尺寸和延长样品浓度范围宽,以及它的低容量的要求。说完这些,与应用程序的挑战仍然DLS蛋白质治疗配方是围绕着数据的解释。白皮书在这个由四部分组成的系列中,周围的常见问题和问题原则,讨论了DLS数据的测量和分析,以帮助减少所需的时间,获取和解释DLS数据的复杂性,在整个开发过程是至关重要的。在本系列的第三个白皮书,我们涵盖了基本类型的DLS反褶积算法用于提取强度加权的粒度分布测量相关图。

动态光散射

动态光散射(DLS)是一种分析技术中使用bioapplications测量粒度分布在低聚物和亚微米大小的范围。DLS测量,散射强度波动相关在时间跨度小,产生一个相关图。粒子扩散系数的分布从测量中提取相关图使用各种反褶积算法,每一种都可以产生不同的结果。确定适当的算法,因此正确的扩散系数的分布,需要一个基本的了解算法的操作限制。

DLS相关图

粒子在溶液中可移动的影响下的布朗运动,测量散射强度将随时间波动,产生一个跟踪似乎代表随机波动强度平均值。信号波动率的变化率取决于粒子的位置,缓慢移动粒子导致缓慢的波动和快速移动的粒子导致快速波动。

相关性是一个2^nd订单统计方法测量non-randomness的程度明显随机数据集。当应用于一个时间强度跟踪,相关系数强度,G₂(τ),计算如下所示,τ是G2的延迟时间和2下标表示自相关强度而不是字段。

直接应用,相关方程可以表示为如下所示的总和,具体如图1所示。

图1:示意图详细测量和施工DLS相关图。

通常,归一化相关系数,使得G₂(∞)= 1。对于单色激光,这规范化实施的相关曲线上限2 G₂(τ₀)和1 G的基线下限₂(∞)。在实践中,理论上限只能实现仔细优化的光学系统。典型实验上限大约有1.8到1.9 G₂或0.8到0.9 G₂- 1,通常是DLS相关图中显示的数据(图2)。

图2:DLS测量相关图6 nm卵白蛋白和95纳米二氧化硅在PBS。

反褶积

散射强度波动测量DLS实验期间的表现波动产生的电场整体解决方案粒子的集合。电场波动是一个叠加的结果字段(或波)所产生的每个散射粒子扩散通过解决方案。所以关于粒子运动的信息包含在电场作用,表明在该领域相关表达式(G₁)下面,E是场函数,Γ衰变率,平均扩散系数D, q是散射向量,λ₀真空激光波长,n是介质折射率,散射角θ,和1下标G₁表明该领域相关。

实际参数测量的强度,在光散射实验中,相当于字段(I = E的平方²),相应的自相关函数通过Seigert关系,彼此相关γ是一个相干因素表达光子收集系统的效率。

所以Seigert关系可以用来从DLS deconvolute粒子运动信息测量强度自相关函数。

累积量分析

累积量分析ISO推荐方法提取平均或Z平均大小DLS测量相关图。累积量分析,单粒子大小家庭假定和相关图是安装在一个指数如下所示,其中一个是相关函数的振幅或拦截,B是基线,Γ衰变率的相关性。

指数拟合表达式是扩大到占多分散性或峰值展宽效应和线性化,如下所示,1^圣时刻(₁)相当于衰变率(Γ)和2^nd时刻(₂)分布宽度成正比(µ₂)。

如图所示,衰变速率与平均扩散系数(D),这有助于确定意味着使用Stokes-Einstein水动力大小关系,其中k是玻尔兹曼常数,T是绝对温度、介质的粘度η,R_H水力半径。累积量的平均大小决定分析是描述为Z(或强度加权平均)。

如上所述,2^nd时刻的累积量分析与分布的宽度。这种关系的表达式给出下面,PdI多分散性指数和σ是一个假设的高斯分布的标准偏差集中在Z平均大小。

累积量分析从其他DLS算法,它是独一无二的收益率只有一个平均尺寸和多分散性指数,没有额外的信息关于的形态分布。虽然并不少见的高斯分布的均值和PdI打印,不建议,由于潜在的误解。如果所需的分布信息,最好的方法是利用一个NNLS算法,都产生一个完整的粒度分布。

NNLS算法

DLS粒度分布来源于测量相关图使用一个非负约束最小二乘算法(NNLS)配件。虽然有各种算法之间的细微差别,所有使用类似的非负最小二乘拟合的方法。

与累积量分析,假设一个理想的领域相关函数相同的扩散范围和适合测量强度相关曲线单一指数,NNLS算法没有假设关于粒子的家庭数量的强度相关函数表示。挑战,当然,是在“多少”粒子的识别家庭或衰变实际上是礼物。在数学领域这是视为一个不适定问题,因为相对少量的噪声可以显著改变积分方程的解,因此预测的数量大小的家庭。

拟合函数,G₁^适合的字段自相关函数可以表示成一个求和的单指数衰减,因子a_我是为每个指数贡献曲线下的面积,并代表了特定的力量吗^th指数函数。

找到最适合通过最小化偏差测量数据点的拟合函数,一个权重因子σ合并,把重点更多放在强烈相关,而不是低相关性(噪声),数据点。

权重因子相关系数成正比,如相关函数值在给定τ值。正如上面提到的,这是给更多的重量高度相关的数据点。作为一个例子,考虑相关曲线如图3所示。作为嵌入视图,明显有实验噪声基线。在缺乏一个权重因子,这种噪声可以解释为“衰变”起源于非常大的粒子的存在。所以的权重函数提供了一种手段解决不适定反褶积实验噪音问题。

图3:自相关函数例子突出基线噪音。

确定的解决方案_我在G₁^适合拟合表达式是通过最小化ξ的偏差²关于每一个_我,然后解决由此产生的方程组。

而具体的细节留给更高级的文本,标准程序求解上述方程构造解的线性组合形式。说完这些,当特征值小,少量的噪声可以使溶液(或Γ的数量_我)非常大,因此前面的不适定问题分类。为了缓解这个问题,稳定剂(α)添加到方程组。这个参数被称为规范和整合,我们正在进行一阶正则化deconvoluted特征函数的线性组合的解决方案。

上面的表达式称为一阶正则化,因为一阶导数(一个_我)被添加到系统的方程。阿尔法(α)参数或调整决定了重点我们把这个导数。换句话说,它定义了平滑度的解决方案。如果α很小,小的影响和解决方案可以很“波涛汹涌”;而一个更大的α将迫使解决方案非常光滑。

除了光滑解的约束,NNLS算法也要求解决方案是物理,即所有_我> 0。这些约束,Z是最小化通过要求第一个衍生品对_我是零。显示之前,此最小化对应解一个线性方程组_我。的解决方案_我值被发现使用一个迭代的方法称为梯度投影法。

归一化显示的_我与R_我(或_我与直径)称为强度粒度分布。峰值的大小是强度加权平均值,得到直接从大小使用以下表达式:直方图。

峰宽或标准偏差(σ),表明未解决的分布峰值本身,也可以获得直接从粒度分布柱状图:

图4显示了一个示例DLS-derived强度加权60纳米乳胶粒子大小分布标准,计算一个NNLS类型算法,随着DLS峰值的平均值和标准偏差。

图4:例子DLS结果60纳米乳胶,直方图的格式。

“最佳”NNLS算法是什么?

DLS仪器的用户的一个常见的问题是“什么是最好的NNLS算法?”。直观地说,有人可能会认为明显的最好方法拟合相关图是使用迭代方法,直到误差平方和最小化。一个完美的噪音免费相关函数,这种方法是理想的。但在实践中,没有所谓的完美声音自由相关图,和最小化的平方和误差噪声的存在会导致错误的结果,没有再现性和最小的有效性。他的问题,“什么是最好的NNLS算法”,是一个很好的一个。

这里的问题是,答案很大程度上取决于被分析样品的类型,所使用仪器的尺寸范围工作,最重要的是,噪音水平测量相关图。有各种各样的名叫NNLS类型算法可用光散射研究人员,通过互联网或通过收集DLS仪器供应商。虽然算法都是基于NNLS,通常会使他们独特的锁定某些变量,如权重因子或调整,以优化算法对于一个给定的一组工具和示例的条件。命名算法的一些例子包括:

CONTIN

CONTIN算法最初是由史蒂芬Provencher和一般DLS分析已经成为行业标准。CONTIN算法被认为是保守的,在阿尔法(α)的选择参数控制的平滑噪声的分布假设适度相关图。因此,粒子分布峰值接近的大小往往是混合在一起CONTIN-derived大小分布。额外的信息,请参阅http://s-provencher.com/pages/contin.shtml。

正则化

玛丽亚·伊万诺娃写的正则化算法,是一种更为积极的算法优化了无尘小粒子样本,如纯蛋白质和胶束。正则化算法利用小参数α,从而假设低水平的噪音测量相关图。因此,正规化派生分布往往有更清晰的山峰。然而,这种低噪声估计会导致幻影(不存在的)峰值如果噪音存在于相关图。

GP & MNM

全科医生和MNM算法、分布式Zetasizer纳米仪器,一般NNLS算法,优化了适合广泛的样本大小和浓度与纳米测量系统。GP(通用)算法是保守的,温和的估计的噪声,是适用于研磨或自然产生的样本。MNM(多个窄模式)算法更具侵略性,噪声估计较低,更适合狭窄的多分散性粒子的混合物如胶乳和纯蛋白质。

代表& DYNALS

代表和DYNALS算法可用于购买通过各种网站。都是类似于行业标准CONTIN,尽管更激进的关于噪声估计。

有两个主要参数变化NNLS算法:权重因子和阿尔法参数(规范)。下表显示了一个比较这两个参数的默认值上面列举的一些算法。注意算法列在表中列出的顺序增加攻击性。

算法	加权方案	α参数
CONTIN	四次	变量
通用	二次	0.01
多个窄模式	二次	0.001
正则化	二次	0.00002

数据权重

如前所述,数据加权DLS反褶积算法的地方强调更大的和更重要的相关系数小而不是那么重要基线值。图5显示了数据的影响权重为1毫克/毫升DLS相关图溶菌酶,过滤后通过20 nm Anotop过滤器。如这个图所示,权重是沿着Y轴延伸出相关图。没有数据的权重,在基线噪音会导致鬼或噪声峰值的出现。

图5:比较二次和四次加权测量相关图1毫克/毫升溶菌酶示例,通过20纳米过滤器过滤后,随着合成大小分布导出使用莫尔文的通用算法。

阿尔法(α)参数或调整

基于NNLS反褶积算法的调整或α参数控制的可接受程度的尖刻合成分布。大型α值生成平滑,解决分布较少,而较小的α值产生更多的分布,具有更高的分辨率。α参数之后,可以简单的描述为预期的估计噪声水平测量相关图。

没有理想的或最好的α参数。适当的值取决于样本被分析。混合物的窄模式(聚合)和强烈散射粒子,降低α参数有时可以提高分辨率的强度粒度分布。考虑图6为例,它显示了α参数分布依赖60 nm和220纳米乳液的混合物。结果推导出使用默认的莫尔文通用规范和多个窄模式算法,r = 0.01和0.001分别是比较指出。

图6:粒度分布对α的依赖强度参数60和220纳米乳胶粒子的混合物。

是明显的在上面的图中,降低α参数导致的增加的数量的解决模式和峰值的清晰度。也是有益的,一旦达到基线决议,合成大小(峰值位置)是独立于α值,只有明显的峰值的宽度变化进一步调整的变化。

α的影响参数的测量大小分布monomodal 220纳米乳胶样品如图7所示。与橡胶混合物,降低调整没有影响测量颗粒大小,并且只是为了减少峰值的明显的多分散性,即降低峰宽。

图7:粒度分布对α的依赖强度参数monomodal 220纳米乳胶样品。

在前面两个例子低多分散性胶乳,更激进的算法利用较小的α值生成符合样本属性的结果。对样品不窄模式粒子组成的家庭但是,积极减少α参数会导致测量数据的深意,和一代的模式或峰值比实际上是存在于样本。

图8显示了α参数对结果的影响大小分布对稀释蛋白质样品。单体的蛋白质有一个已知的流体力学直径3.8海里。条件下使用,蛋白质存在也被称为低阶低聚物的混合物。这个数字明显,强度加权平均数α的大小的样本是独立的参数选择,并符合预期的低聚物的混合物的平均大小。如果选择了通用算法,α值为0.01,峰宽也代表预期的多分散性的混合蛋白寡聚物(~ 25 - 30%)。减少α参数(< 0.01)然而,生成一个幻峰2 nm左右,并导致错误的结论,只有两个粒子的样本是由大小,其中一个是远小于单体本身。

图8:α参数对结果的影响大小分布为0.3毫克/毫升样品溶菌酶在PBS pH值6.8。

图9所示的结果是另一个例子,不那么咄咄逼人的α值莫尔文通用算法是使用适当的值在粒度分布的生成。没有稳定的代理商,变性血红蛋白(Hb)和聚合温度> 38°C。变性蛋白质时,聚合形成的大小是随机的,没有特异性,即非常多分散的。因此,分布的最佳代表实际样品是使用莫尔文通用算法,生成一个α值为0.01。减少α< 0.01参数值会导致两个明显独特的大小类的一代在300 nm和800 nm区域与样品的实际属性不一致。

图9:α参数对结果的影响大小分布对变性血红蛋白在PBS缓冲44 C。

多个解决方案(CONTIN)

CONTIN DLS算法中是独一无二的,它生成一个解决方案的集合,每一套合格的描述符。描述符用来确定最可能的解决方案是1)峰的数量,2)自由度,3)α参数,和4)拒绝的概率。最可能的解决方案是选择使用精简原则,即在消除所有解决方案与先验信息不一致,最好的解决方案是一个揭示最少的新信息。

图10显示了一个比较CONTIN生成的解集的60和220 nm乳胶混合。如这个图所示,一个解决方案(CONTIN 1)是一致的结果使用莫尔文多个窄模式生成算法(α= 0.001),是一个很好的表示实际的样品。然而,CONTIN确定最可能的解决方案是CONTIN 6,它显示了一个混合的人群形成单一的峰高多分散性。

图10:CONTIN生成解决方案的对比组60纳米的大小分布和220纳米乳液混合物。

相比莫尔文通用和多个窄模式算法,CONTIN比GP算法往往是更保守。虽然这适用于噪声识别和管理(稀释蛋白质在图11),它也可以导致明显减少颗粒大小分辨率(图11)胶乳混合的混合物。

图11:比较CONTIN(▬)、通用(▬)和多个窄模式(▬)结果的混合物60和220 nm胶乳和稀释蛋白质样品(0.3毫克/毫升溶菌酶)。

最终解决问题的“最佳DLS算法是什么?”真实的答案是,没有最好的算法。每个算法给研究者有用的信息。最好的方法是一些你所知道的与你怀疑什么样本,比较各种算法的结果,识别的优点和局限性,然后寻找结果的鲁棒性和可重复性。换句话说,如果多个测量表明肩宽峰,融入到一个独特的可重复的人口在应用更为激进的算法上,机会是强大的,这种独特的人口是真实的。如果重复测量产生矛盾,那么最好是宁可更保守的算法,比如莫尔文通用或CONTIN。