相结合的动态光散射(DLS)和拉曼光谱提供了能力调查大量的化学结构和物理参数对biotherapeutic配方条件下蛋白质。
在这里,我们表明,通过同时监测胶体(DLS)和构象(拉曼)模板单克隆抗体的稳定性(mAb)和修改单克隆抗体(mmAb)提供了重要的见解马伯的机械热应力的影响和mmAb。
特别是,这个组合DLS /拉曼技术显示,较低的热稳定性(早期寡聚化)mmAb模板马伯相比,是由一个叔酪氨酸残侧链结构变化;一种机械的观察,不能显示完全由单独的这些技术的使用。
在发展生物制药产品,描述热稳定性是重要的一步的过程中学习和优化单克隆抗体(mab)及其配方。差示扫描量热法(DSC)是用来描述热行为的标准技术,提供一个电热从哪一个可以获得稳定性和热力学性质。为了减少聚合在加热、DSC样本运行在低浓度(0.5毫克/毫升-1.0 mg / mL),因此这项技术并不是有效的测试浓度更高的稳定性,制定产品的典型。同时,尽管假设是不会发生聚合由于加热这些低浓度的样品,没有办法从获得的数据证实了这一点,和样品的视觉证据聚合往往DSC运行的最终产品。DLS的组合(描述大小和聚合)和拉曼光谱(提供见解发生)的二级和三级结构变化使热稳定性研究配方浓度(辅料),而且可以区分从聚合事件展开。
之前与球状蛋白质研究(见通知白皮书上使用DSL /拉曼描述BSA和溶菌酶)的二级结构变化引起的热应力相当重要,mab的二级结构是相当稳定的。这是由于这样的事实:富含β-sheet结构框架,与二硫化共价债券提供额外的稳定性。热应力本身并不是预期的明显扰乱二级结构。
在本白皮书中给出的案例研究,我们比较马伯的热稳定性,结构修改(即修改单克隆抗体或mmAb)单克隆抗体和相应的模板,或者是马伯的修改已经完成。
莫尔文仪器Zetasizer螺旋(z螺旋)集成的光纤耦合拉曼光谱仪Zetasizer Nano ZSP提供DLS(胶体稳定性)和拉曼(构象稳定性)的数据按顺序在一个样本。Zetasizer纳米系统集成了专有的非侵入性的后向散射(上司)探测器技术与动态(DLS),静态(SLS)和电泳(ELS)光散射测量蛋白质的水力半径0.15 nm - 5µm,从0.1毫克/毫升≥100毫克/毫升。使用785 nm激发拉曼光谱收集(~ 280 mW)从150厘米1- 1925厘米1在4厘米1决议。马伯马伯和修改(mmAb)提供了在10毫米50毫克/毫升缓冲区在pH值为5.5。样本储存在4°C,直到进行了研究。样本整除(~ 120µL)置于一个3毫米石英试管和定位在一个舱提供温度控制在0°C - 90°C±0.1°C。热坡道研究通过收集拉曼和DLS数据进行一系列预定义的0.1°C - 5°C步进式增量。等温孵化所进行的研究收集一系列拉曼和DLS数据在一个预定义的时间间隔在所需的温度点。
马伯,mmAb样本加热,规模和结构特性监测通过DLS和拉曼实验。图1显示了拉曼光谱的马伯和mmAb在低和高温度,并证实了分子的二级结构的稳定性。光谱区域对应于这些构象,特别是我和第三区域的酰胺,转移或峰值强度变化不显著,只有轻微的频带展宽,主要在我地区的酰胺。
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马伯的二级结构/ mmAb可以用偏最小二乘建模分析的光谱获得参考蛋白质样品与已知的二级结构元素被用来预测未知蛋白质的二级结构样本。图2显示了温度依赖的四个结构图案的预测模型(即α-helix、β-sheet、β-turn和随机线圈)马伯(图1)和mmAb(图1 b)。尽管相对较小的光谱(图1)和结构(图2)观察到的变化(如螺旋结构显示<马伯和mmAb结构变化为10%,相比减少~ 40% BSA的螺旋结构内容观察加热对其转变温度),它仍然可以辨别,mAb mmAb表现出不同的行为(图2)。
在图2 C, mAb显示一个突然的转变接近70°C,而mmAb显示较低的起始温度与双过渡~ 50°C和65°C,分别。这表明马伯,mmAb热应力的反应是不一样的,即使这不是明显的光谱的直接比较。
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有趣的是,芳香族侧链的热剖面标记,即色氨酸(Trp)和酪氨酸(酪氨酸),显示马伯,mmAb之间的显著差异。如图3所示,光谱标志象征之间的二面角的吲哚环和肽键平面Trp侧链(功能在1550厘米1)显示一个急剧转型的马伯~ 69°C,而mmAb早期发病,~ 66°C,其过渡相当广泛。指出进一步的差异在图3 b中,光谱描述氢键环境标志的酪氨酸的侧链是策划。马伯展览一个,大幅转变~ 69°C。然而,mmAb跟踪显示双转型,在拐点~ 53°C和~ 62°C。这个观察,随着构象稳定的二级结构,表明酪氨酸侧链(添加修改的一部分),可能引发早期构象变化导致较低的热稳定性。
拉曼光谱显示结构性变化,但并没有解决展开和聚合过程中热应力引起的尺寸变化。DLS和拉曼的结合使我们同时分析这两个重要特征。
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图4表明,聚合发生的马伯发生在温度高于mmAb,再次证明其热稳定性高。mmAb展品一样的双重转型的拉曼数据,专门为酪氨酸H-bonding环境。DLS Z-average大小数据显示,较低温度过渡是一个寡聚化事件~ 50°C。mmAb过渡温度更高(~ 65°C)是一个快速和主要聚集事件,如马伯样本> 70°C。PDI趋势,如图4所示,是一致的。马伯的样本,PDI波动约0.1,直到一个显著增加在~ 60°C。PDI mmAb示例显示了两个峰值的进化~ 50°C和~ 62°C,指示转换从大小相对均匀分布到多分散的分布,然后回落至相对同质的,最后又变得相当多分散的。这表明mmAb样品在第一次转型,形成低聚物,这些寡聚物形成大骨料表示在第二过渡。
所有这些观察是一致的与拉曼数据上面了。此外,如果我们认为的早发性单一Trp过渡和酪氨酸的双重转型,拉曼和DLS数据综合起来表明较低的热稳定性(早期齐聚反应)的特征mmAb可能引发的三级酪氨酸侧链结构变化。
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DLS决定不仅大小本身,而且大小分布,这不是获得使用静态光散射或浊度测量。图5 a1说明马伯,~ 100 nm的峰值出现在~ 65°C,而对于mmAb b1(图5),人口的颗粒大小是出席~ 50°C。应该注意的是,由于DLS的极端敏感性,0.1%(按体积)大骨料的存在将产生相当于粒子散射强度99.9%的1/10th他们的大小。因此,转变温度来源于体积加权分布高于相同的值来自一个强度加权分布。马伯,体积分布显示一个明确的增加在~ 70°C(图5 a2),而对于mmAb,峰值变化~ 57°C(图5 b2)。
PDI似乎是最敏感的指标聚合,Z-averaged相比体积大小和分布。发病在图4 b中,聚合温度从Z-averaged大小~ 65°C,但分析PDI将开始温度低至~ 60°C。
重要的是要注意,确定水动力的大小从动态光散射是基于Stokes-Einstein方程,需要已知溶液粘度。在~ 5%重量浓度相对较低,使用水的粘度来近似的解决方案是合理的。说,一旦蛋白质聚合、沉淀,或稠化,这近似最有可能不再有效。在这种情况下,大小值派生可能是不精确的,但它可以假设他们表现出的趋势是定性正确。
上述结果强烈表明,mAb的热稳定性资料的差异和mmAb将齐聚mmAb,由三级结构(侧链)展开。然而,还不清楚的是这一过程的动力学和稳定的低聚物。进一步的实验调查mmAb齐聚反应的动力学进行了。具体来说,等温孵化项目在转轨前(46°C),转型期(53°C)和post过渡(60°C)进行了温度。结果如图6所示。
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孵化温度达到时,46°C,慢慢增加,规模和Trp和酪氨酸喇曼制造商乐队表现出明显的峰值变化。然而,与53°C,规模迅速增加从10 ~ 35 nm,然后稳定下来。同时,酪氨酸峰值位置下降,Trp峰值位置略有变化。更具体地说,从856.8厘米酪氨酸峰的位置变化1- 855.5厘米1,见图3 b第一过渡。60°C,规模迅速增加到3小时内超过40 nm, Trp和酪氨酸峰值位置低,迅速转变又酪氨酸峰值位置转向~ 855.5厘米1。
这些观察结果进一步支持新添加或修改的建议酪氨酸残基引发低聚物形成温度较低,导致最终为修改后的单克隆抗体较低的热稳定性。更有趣的是,在返回起始温度等温孵化后,酪氨酸峰值位置仍然降低了,但峰值的位置Trp恢复某种程度上(数据没有显示)。
正如上面提到的,最后一个峰值的位置后酪氨酸53°C孵化接近后看到的第一个转变发生在热增加实验,如图3所示。因此,我们停止了孵化60°C,在第一个过渡完成,冷却到20°C测试寡聚物的热可逆性。
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在图7中,初始大小~ 50 nm和保持这样,直到最后聚合开始接近64°C。Trp和酪氨酸不表现出双重转换特点,只是一个过渡~ 64°C,作为大小被过渡。这表明低聚物形成于~ 50°C被冷却稳定,不分离。稀释试验(数据未显示)也表明齐聚反应是不完全可逆的。
通过结合DLS和拉曼光谱,我们已经清楚地证明了以下几点:1)单克隆抗体测试有不同的球状蛋白质二级结构转换概要文件相比,模型;2)芳香族侧链中残留马伯显示清楚构象/结构转换与热应力;3)修改马伯的热稳定性低于马伯,证明由低聚物的形成在~ 53°C;4)低聚物形成的机制似乎是由酪氨酸侧链的改变;5)形成的寡聚物是稳定的,不可逆的冷却或稀释。
我们注意到:1)多个DLS-derived参数可以被使用,例如Z-averaged大小,PDI,粒度分布,但PDI可能是最敏感的变化;2)尺寸值需要仔细解释如果溶液粘度变化明显的水;3)拉曼光谱标记很敏感,可以接多个转换即使看到很微妙的变化。这些实验都是复制与合理的再现性。
莫尔文仪器的生物科学发展倡议(BDI)成立加速创新,开发和推广新技术、产品和能力来解决生物科学市场测量需求得不到满足。
