相结合的动态光散射(DLS)和拉曼光谱能够提取丰富的化学结构和物理信息biotherapeutic配方条件下蛋白质。
拉曼光谱同时获取蛋白质二级结构(酰胺我和III)和三级结构标记(芳香族侧链,二硫键,氢键,疏水性)。这些高阶结构决定在执行实际配方浓度(50毫克/毫升或更高mab),而不是在传统的方法所需的低浓度,即不到几毫克/毫升圆二色性(CD)。
利用拉曼光谱、蛋白质二级和三级结构摄动/展开,熔化温度,温度发生聚合和
范特霍夫焓值都可以导出,从而改善理解竞争途径展开/结构变化和聚合,最终,独特的见解(s)的聚合机理,以帮助改善配方的稳定性。
独特的拉曼光谱耦合和DLS能够同时关联与胶体蛋白质结构参数来提高蛋白质治疗配方的理解在各种压力的情况下,例如,热,制定、化学降解,外在的微粒。
拉曼光谱获取蛋白质的二级和三级结构信息通过监测分子振动。动态光散射(DLS)是一个主力技术确定水动力直径biotherapeutic蛋白质在溶液中,除了他们的多分散性和交互。通过结合这两种分析方法集成到一个单一系统中,大量的化学结构和物理参数可以确定。蛋白质的二级和三级结构、熔化温度、起始温度的聚合和转变焓值都可以导出,以及聚合的倾向,蛋白质的溶解度,和潜在的高粘度浓度制定。结果从DLS的互补性和拉曼光谱在同一样本可以提供独特的见解独特的聚合和演变机制。这里我们介绍拉曼光谱的作用理解蛋白质的构象稳定性疗法。
莫尔文仪器Zetasizer螺旋(z螺旋)集成的光纤耦合拉曼光谱仪Zetasizer Nano ZSP提供DLS(胶体稳定性)和拉曼(构象稳定性)的数据按顺序在一个样本。Zetasizer纳米系统集成了专有的非侵入性的后向散射(上司)探测器技术与动态(DLS),静态(SLS)和电泳(ELS)光散射测量蛋白质的水力半径0.15 nm - 5µm,从0.1毫克/毫升≥100毫克/毫升。使用785 nm激发拉曼光谱收集(~ 280 mW)从150厘米1- 1925厘米1在4厘米1决议。示例整除(~ 120µL)放置到一个3毫米石英试管和定位在提供温度控制的温控室从0°C - 90°C±0.1°C。热坡道收集拉曼和DLS数据进行的研究是在一系列预定义的0.1°C - 5°C步进式增量。等温孵化研究由收集一系列拉曼和DLS数据在一个预定义的时间间隔在所需的温度点。
拉曼光谱是一种有效的方法来确定蛋白质二级结构特征。各种二级结构的确定算法已经提出,包括1)带反褶积的特别信息丰富的光谱特性称为酰胺我带,2)一个多元建模方法,其中包括一个广泛的光谱范围(~ 990厘米1到1730厘米1)。
我带的酰胺,~ 1600厘米1到1700厘米1结果主要来自C = O拉伸结合少量的氮。酰胺III特性,~ 1200厘米1到1340厘米1,结果从碳氮耦合- h弯曲。这些乐队的整体形状与二级结构变化。一个乐队在~ 930厘米1到950厘米1是基于cα- c骨骼拉伸模式,其强度的α-helix内容的说明。上述特性的主要特点是乐队的蛋白质二级结构和表1中列出了一些。
| 拉曼位移(cm1) | 蛋白骨干 | 二级结构的主题 |
|---|---|---|
| 1670 - 1680 | 酰胺我 | β-Turn /随机β-space |
| 1660 - 1670 | 酰胺我 | β-sheet |
| 1650 - 1655 | 酰胺我 | α-helix |
| 1330 - 1340 | 酰胺三世 | α-helix |
| 1235 - 1250 | 酰胺三世 | β-sheet |
| 930 - 950 | 骨骼拉伸 | α-helix |
拉曼光谱图1礼物代表BSA(牛血清白蛋白)热处理前后,突出上述主要二级结构特性。在这个例子中,明确从α-helix丰富结构过渡成β-sheet丰富结构是显而易见的。各种各样的分析(例如光谱反褶积、二阶导数)可以应用于酰胺我三世,和骨骼拉伸区域二级结构的详细分析。这些方法将在未来技术笔记。
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多元的方法,另一方面,认为整个光谱轮廓,不只是一个拉曼乐队或频率。在这种方法中,光谱和结构性的数据代表数量的蛋白质被用来创建一个请模型可以预测蛋白质结构未知的蛋白质,即那些没有包含在图书馆。表2中给出的数据展示的结构信息的类型可以自动源自这个模型,连同相比,从www.pdb.org报道值。
| 蛋白质 | PDB文件 | 多变量模型值 | PDB的价值 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| α-helix | β-sheet | α-helix | β-sheet | ||
| 伴刀豆球蛋白一 | 3 cna | 0 | 46 | 0 | 40 |
| 胰蛋白酶 | 3 rn3 | 18 | 33 | 20. | 35 |
| 溶菌酶 | 7 lyz | 28 | 8 | 39 | 10 |
| 人血清白蛋白 | 1 ysx | 69年 | 0 | 67年 | 0 |
图2比较α-helical和β-sheet内容通过多变量预测模型作为温度的函数对BSA的同一组数据如图1所示。它清楚地显示了二级结构的改变随着温度的增加;这主要是增加β-sheet和随机内容,而α-helix显著下降。
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拉曼光谱也高度敏感的芳香族侧链的对称振动模式,即苯丙氨酸(法F),酪氨酸(酪氨酸,Y)和色氨酸(Trp, W),因此被广泛用作探针的蛋白质三级结构。有几种行之有效的和经常使用的拉曼标记提供了洞察这些芳香族侧链的环境。表3总结了占主导地位的三级结构带作业,和相应的结构迹象。
图3中清楚地说明了随着温度的增加,二级结构(绿色圆圈),从α-helix丰富β-sheet丰富结构:α-helix从40%下降到18%,和β-sheet增加从6%降至28%。并发与二级结构的改变是芳香族侧链的变化。以Trp为例:1360厘米的比例减少1/ 1340厘米1表明可能暴露于一个水环境。一个2厘米1转变W17地区(870厘米1-885厘米1)表明氢键结构的变化这些侧链。W3地区(~ 1550厘米1)改变了3厘米1,表明二面角的变化从100°到接近90°。酪氨酸地区也显示有趣的行为,一个初始峰值附近的836厘米1在20°C,过渡到两座山峰为828厘米1和853厘米1在80°C。应该注意的是,并不是所有的芳香族侧链将显示的变化,甚至在同一温度改变。更重要的是,每个蛋白质都是独一无二的,这些标记应该仔细分配给特定的蛋白质。
| 拉曼位移(cm1) | 源 | 结构说明 |
|---|---|---|
| 1360/1340 > 1 | Trp费米紧身上衣(支W7) | 吲哚环在疏水性环境中或在接触脂肪链 |
| 1360/1340 < 1 | Trp费米紧身上衣(支W7) | 吲哚环的亲水环境或暴露于水介质 |
| 1550年 | Trp二面角(W3) | 吲哚环之间的角度和肽键平面 |
| 870 - 885 | Trp氢键(W17) | 883年非H-bonded 877年中等强度 871强H-bonded |
| 760年 | Trp (W18) | Cation-π交互 |
| 850/830 ~ 0.25 | H-bonding的酪氨酸 | 捐赠者的强劲H-bond |
| 850/830 ~ 1.25 | H-bonding的酪氨酸 | 供体和受体的强劲H-bond /暴露于水环境 |
| 850/830 ~ 1.25 | H-bonding的酪氨酸 | 受体的强劲H-bond /埋酪氨酸 |
| 1002 - 1004 | 板式换热器环呼吸模式 | 正常拉曼强度 |
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二硫键是硫单位在半胱氨酸残基之间的共价键,并为维护本机蛋白质结构是至关重要的。三个独特的双硫键矫形器归纳如表4所示。更具体的定义不同的矫形器将在未来的应用程序。
| 拉曼位移(cm1) | 源 | 结构说明 |
|---|---|---|
| 508 - 512 | s拉伸 | GGG构象异构体 |
| 523 - 528 | s拉伸 | GGT构象异构体 |
| 540 - 545 | s拉伸 | TGT构象异构体 |
图4显示了二硫的溶菌酶(二硫化四总债券)之前和之后的热处理。在20°C, 508厘米1,528厘米1,545厘米1乐队表明,溶菌酶二硫债券角色分配给gauche-gauche-gauche (GGG) gauche-gauche-trans (GGT)和trans-gauche-trans (TGT)矫形器。在80°C,峰值为528厘米1和545厘米1已经消失了,这表明只有GGG构象异构体仍然存在。在存在还原剂(二硫苏糖醇-德勤)二硫键强度降低随着时间的推移,特别是GGG构象,表明这些矫形器的损失。
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拉曼光谱具有显著的承诺作为主力技术在迅速扩张的领域的蛋白质疗法。抽样的优点,强度和选择性承诺的未来的应用包括法医粒子识别(硅油液滴、玻璃等);蛋白质结构测定接口(油水,金纳米粒子);蛋白质动力学(H / D交换);加速退化(热、还原剂、搅拌和氧化),和许多其他人。DLS和拉曼是互补的技术,当数据都作为一个整体,独特见解的机制可能阐明蛋白质聚合。未来的应用笔记将探索规模和蛋白质结构之间的关系,研究这样的问题:1)蛋白质构象的变化触发一个聚合的事件,或反之亦然?;2)有一个标记,可以预测蛋白质稳定地高效和可靠吗?
DLS和拉曼光谱的结合和集成到一个仪器平台提供了独特的分析能力来确定蛋白质的二级和三级结构,熔化温度、大小和出现聚合为同一样品在不改变测试条件。这里有独特的描述spectra-structure可以使用拉曼光谱相关的属性。随后,我们描述DLS获得的效用体积粘性/限制扩散相互作用参数(kD(B),粒子相互作用参数22)、熔化温度、温度发生聚合和转变焓变的指标制定稳定(理解蛋白质疗法的胶体稳定性与动态光散射)。未来的研究将报告独特的相关性,可能来源于DLS的组合和拉曼光谱改善动力学的理解,热力学和机制(s)的聚合和关联的特定蛋白质结构主题聚合和配方稳定提高产品知识。
莫尔文仪器的生物科学发展倡议(BDI)成立加速创新,开发和推广新技术、产品和能力来解决生物科学市场测量需求得不到满足。
