神经科学中的关键RNA测序技术

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发布日期:2021年4月28日

自20世纪70年代引入北方印迹，定量聚合酶链式反应(qPCR)和微阵列技术以来，以转录组为重点的研究已经取得了长足的进展。近年来，基于下一代测序(NGS)技术的发展彻底改变了科学家分析基因表达和调控的方式。RNA测序(RNA-seq)使用NGS来检测、量化和分析转录组。与旧的方法相比，RNA-seq提供了更好的分辨率和覆盖范围，而且关键的是，它不需要预先了解所分析的转录组。这打开了更多的大门新创发现。这些进步不仅使科学家能够量化基因表达，而且还能发现新的转录本、替代剪接位点和等位基因¹．RNA-seq的广泛使用帮助降低了设备成本，使这种分析非常容易获得，并在包括神经科学在内的几乎所有科学和医学领域带来了突破性的发现。

神经科学的科学进步非常需要这种技术来解决科学家在研究人体最复杂器官时遇到的限制。此外，虽然神经系统的细胞异质性是人体任何系统中最高的，但这种细胞多样性和长距离连通性的很大一部分仍在很大程度上未被发现。克服这些限制依赖于开发和实施高通量、精确的技术，如适用于神经科学的RNA-seq。

这项技术进步的长期目标是更好地了解大脑的生理环境，分析其转录组，并将其与大脑独特的生理学联系起来。在健康的环境中识别这些机制将加速揭示与疾病相关的表型和生物标志物，并支持神经病理学的药物发现。

在这个列表中，我们探讨了RNA-seq技术在神经科学中的主要应用方向，以及它们对该领域的贡献。

1.单细胞RNA测序(scRNA-seq)

解决大脑细胞异质性的问题需要在单细胞水平上探索系统。顾名思义，单细胞rna测序(scRNA-seq)包括分析单个细胞中的基因表达。

scRNA-seq工作流程首先通过微流体系统、激光捕获微解剖或荧光激活细胞分选(FACS)从一块组织中分离出单个细胞，最后一种技术是最常用的技术。这种分离的物质成为RNA-seq分析的起点，包括RNA分离和mRNA富集，随后是片段化，转化为互补DNA分子(cDNA)，并添加测序适配器。与适配器结合的cdna形成“DNA文库”，将对其进行测序和分析。自2009年引入该方法以来²scRNA-seq不同平台的开发为研究人员在细胞分离方法、吞吐量水平、覆盖范围和敏感性方面为其特定项目找到最佳解决方案提供了选择^3.．

2.Patch-seq

神经膜电位是可兴奋性神经细胞的一个基本特征，可以用膜片钳技术来处理。膜片钳包括使用与细胞膜紧密接触的微量移液管测量细胞的电特性⁴．RNA-seq的技术进步正在催生包括patch-seq在内的多种脑特异性RNA-seq方法。它提供了全细胞膜片钳记录与RNA-seq分析的结合。遵循经典电生理学记录⁵，细胞rna被提取并测序。成立于2015年⁵在过去的五年里，已经出现了一些创新，例如实现了更精确和差异化的RNA-seq测量，不仅涉及细胞质rna，还涉及定位于树突和轴突的远端rna⁶．Patch-seq可以应用于不同的大脑区域，可以非常准确地看到单个神经元不同部分的整个转录组。虽然patch-seq仍处于起步阶段，但这些特征使得该方法在研究与远端RNA和RNA运输相关的疾病方面非常有前途。

3.荧光原位RNA测序(FISSEQ)

蛋白质表达的时空调控对正常的脑功能和发育至关重要。在调节蛋白质亚细胞定位的途径中，mRNA定位是保证蛋白质在神经元细胞中正确分布的主要机制⁷．研究RNA沿神经元的传输对于理解大脑功能至关重要。最初，这个问题是用原位RNA分析。这项技术的最大限制是它仅限于少量注解良好的生物标记物。2015年，Wyss研究所的George Church团队通过开发FISSEQ (RNA荧光原位测序)方法成功克服了这一问题⁸．FISSEQ序列原位一个固定细胞或组织的整个转录组，并将表达水平与给定分子的空间定位联系起来。该技术包括在固定样本上进行逆转录(RT)反应，将RNA转化为互补DNA (cDNA)。cDNA分子在分子水平上发生扩增反应之前被读取，结合可通过共聚焦显微镜分析的荧光信号。FISSEQ方案适用于大范围的样本，包括培养细胞、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)和新鲜冷冻组织样本，全封装果蝇胚胎和类器官⁸．

4.投影序列的多重分析(MAPSEQ)

神经回路是通过突触相互连接的神经元群，这些突触可以位于大脑远端区域，但在功能上相互连接。追踪神经回路连通性的经典方法依赖于向神经元注射一种可以用显微镜检测到的染料。最近，Anthony Zador的团队开发了一种跟踪单个神经元电路的新方法⁹．测序投影的多重分析(MAPseq)包括将30bp序列的RNA条形码注入目标大脑区域。每个条形码将绑定一个分子，该分子将通过单个神经元轴突通路到达其最终突触目的地。然后，将大脑解剖成切片，提取并测序条形码mRNA分子，给出来自源区域的每个条形码RNA的电路模式的信息。这种新方法大大减少了单神经元投影分析的时间，并大大增加了一次可以分析的神经元数量。

5.BARSEQ解析条形码解剖

2019年，Zador的团队推出了升级版的MAPseq——通过测序解决的条形码解剖(BARseq)¹⁰．与它的祖先相似，BARseq通过使用rna靶向条形码对脑回路进行高通量测绘。这里的新奇之处在于进行了测序原位与MAPseq不同，MAPseq是将大脑切成薄片，然后提取rna并进行测序。与用MAPseq实现的相比，这种修改为条形码的初始位置以及跟踪电路提供了更高的空间分辨率。Zador和他的团队继续致力于下一代基于rnaseq的测绘技术，这将使我们更接近于了解健康和神经病理学中的大脑连通性。

结论

RNA-seq方法的革命涉及许多研究领域的趋势，重点是高通量的单细胞技术。我们可以看到RNA-seq技术也在以更有针对性的方式发展，以寻找解决当今神经科学中最突出的局限性的方法。当涉及到大脑时，新技术正试图将RNA-seq与其他对神经元功能至关重要的参数结合起来，如电活动、信使分子定位或神经元电路组织。

随着这些方法的快速发展，科学家们希望对大脑的复杂结构、过程和交流有更好的了解，并希望在接下来的几年里带来新的治疗方案。

引用:

王泽，格斯坦，M. &斯奈德，M.(2010)。RNA-Seq:转录组学的革命性工具。纳特·热内牧师1057 - 63。
唐,F。et al。(2009)．单细胞mRNA-Seq全转录组分析。Nat方法。6, 377 - 382。
穆强，陈勇，王杰(2019)。使用单细胞测序破译大脑复杂性。基因组学。蛋白质组生物信息学17, 344 - 366。
Segev, A.， Garcia-Oscos, F. & Kourrich, S.(2016)。脑切片的全细胞膜片钳记录。J. Vis. Exp2016, 1 - 10。
卡德威尔，c.r.。et al。(2016)．使用Patch-seq对单个神经元进行电生理、转录组和形态学分析。生物科技Nat。》。34, 199 - 203。
van den Hurk, M.， Erwin, J. A.， Yeo, G. W.， Gage, F. H. & Bardy, C.(2019)。勘误:Patch-seq方案分析来自人类多能干细胞的整个单个神经元的电生理学、形态学和转录组。前面。摩尔。>。12, 11 - 12。
Zappulo,。et al。(2017)．RNA定位是神经突富集蛋白组的关键决定因素。Nat。Commun。8, 1 - 12。
李，j.h.。et al。(2015)．RNA荧光原位测序(FISSEQ)用于完整细胞和组织中的基因表达谱。Nat。Protoc。10, 442 - 458。
凯布舒尔，j.m.et al。(2016)．高通量单神经元投影的条形码RNA测序。神经元,91, 975 - 987。
陈,X。et al。(2019)。使用原位测序的远程神经元投影的高通量映射。细胞，179772 - 786. - e19。