细胞培养污染:支原体和问题细胞系继续引起关注

细胞培养污染是生物和生物医学研究以及生物制剂生产的主要关注点。虽然有些污染物相对明显，如细菌过度生长，但有些污染物远不那么明显，例如:化学物质微生物支原体或病毒污染物，以及其他细胞系的污染。因此，这是必须遵守的最佳实践防止文化污染，并保持警惕，一旦发生识别。防止化学污染是相对直接的，这通常是由肮脏的实验室器皿或培养试剂引入的。预防措施包括使用一次性实验室级塑料器皿或经过多次清洗、漂洗和高压灭菌的可重复使用玻璃器皿，以及实验室级试剂和无内毒素血清。细菌和真菌污染可以通过在培养基中添加抗生素和抗真菌药以及在层流罩中实施无菌技术来减轻。良好的无菌技术还可以防止细胞培养物与其他细胞系的交叉污染。

尽管良好的无菌操作可以最大限度地减少支原体和病毒污染，但它并不是安全的，培养物仍应定期进行检测。此外，无菌技术不能保护从另一个实验室获得的细胞系，如果它们已经被污染，这是支原体引入实验室的常见途径。确实，支原体读数在9395人中的11%在NCBI序列阅读档案的一项调查中发现了啮齿动物和灵长类动物的样本。新获得的细胞系应自动检测支原体，以防止扩散到已建立的培养。从其他实验室获得的细胞系也会出现类似的问题，这些细胞系可能被错误识别或交叉污染。因此，最近获得的细胞系也必须是通过身份验证特别是如果它们不是直接从信誉良好的存储库获得的。

支原体混乱:高通量检测揭示

显然，支原体是一种严重的潜在疾病 长期存在的 和 广泛的 在研究和生物制药环境中的问题。“支原体污染的细胞培养是一个主要的研究目的和生物制剂的生产，”Eloit教授解释说 病原体发现实验室 巴斯德研究所。“使用受污染的培养物进行研究可能会产生误导或有偏见的结果，因为支原体可以影响细胞特征，例如 基因表达 和 代谢动力学 ，或诱导恶性转化。对于生物制剂生产，支原体感染可抑制细胞增殖或诱导死亡。它还可能对细胞培养物的生物学特性产生不利影响，从而损害细胞表达重组蛋白的能力，或影响细胞对病毒感染的易感性。从安全的角度来看，支原体可能会危害健康 危害 在生物制品方面。”

与细菌不同，支原体没有细胞壁，这使得它们对抗菌剂具有抗性。“不幸的是，培养基中的抗生素补充不一定能预防支原体感染，也不一定能解决预先存在的感染，”Eloit讨论了这种有弹性的微生物。因此，无论是用于研究的细胞系，还是用于生物制剂生产(如疫苗和抗体)的培养物，都必须定期检测支原体。根据监管要求，即使是最终的生物制品也必须进行测试。”

虽然有现有的支原体检测方法，但都不理想且存在一定的缺陷;因此，没有一种测试方法被认为是金标准方法。“支原体很灵活，因为它们缺乏细胞壁，因此不采用标准形状。这使得它们在视觉上很难被发现 显微镜 在宿主细胞中。用DNA染料Hoechst染色使支原体从宿主细胞核分化时更加明显，但这种方法是非特异性的，”Eloit解释说。“这叶子 分子技术 培养支原体本身，然后进行表型表征，这比镜检更可取。试图通过培养检测支原体的问题是，一些种类不容易培养。另外，支原体可以在特化指示细胞系中扩增，然后进行非特异性Hoechst DNA染色。虽然这些方法可以特异性地检测活支原体，但由于培养步骤，它们需要专门的工作人员和耗时。相比之下，基于pcr的方法灵敏、特异、快速;然而，它们不能区分活的支原体与死的支原体或试剂中存在的其他惰性核酸序列来源。”

由于缺乏黄金标准，Eloit有兴趣开发检测支原体以及其他潜在有害物质的改进方法 微生物和病毒 ．最近，他和他的团队开始工作 高通量测序 (HTS)用于支原体“一针”检测。“重要的是，我们的HTS方法结合了支原体培养和PCR的优点。我们的方法是特异性的，敏感的，相对快速的，就像PCR，但也能够区分核酸从活的支原体和死的支原体或外源性惰性核酸，如培养。我们的方法通过向培养基中添加修饰过的核苷酸来实现这一点。只有活的支原体将这种修饰过的核苷酸整合到它们的DNA中，我们可以用高温超导检测到。”

这种新方法加入了基于HTS的日益增长的诊断类别。Eloit展望未来:“我们预计HTS将更广泛地应用于监测细胞培养。”“这些方法是不可知论的，可以检测到所有已知的微生物和病毒，甚至是目前未知的。随着监管机构更新指南，HTS将有助于测试由细胞培养生产的生物制剂的安全性，如疫苗。在COVID-19疫苗开发等快速变化的形势下，快速检测至关重要。除了检测微生物或病毒污染物，HTS还有助于表征细胞生理学和细胞培养修饰对工艺优化的影响。另一个应用是用于基因治疗的转基因细胞系或病毒载体的表征。我们只是触及了HTS能做的事情的表面!”

RRIDdance好!使用rrid去除文献中的问题细胞系

有问题的细胞系 仍然是生物和生物医学研究中的一个问题。这些有争议的细胞系来自于错误的标记，或者一个细胞系被另一个细胞系意外污染，最终超过了原来的细胞系。尽管数据库存在已知的问题 被污染或被错误识别 细胞系，例如， Cellosaurus 在美国，它们继续被用于研究，这可能会导致难以复制或准确解释的不可复制或不确定的结果。 安妮塔·班德罗斯基博士 长期以来，加州大学圣地亚哥分校(UCSD)生物系统研究中心一直对提高生物和生物医学研究的可重复性感兴趣。在这种兴趣的驱使下，她参与了创作 SciCrunch ，由公平数据信息学( 外国直接投资 加州大学圣地亚哥分校实验室。他们的任务吗?使数据公平:可发现、可访问、可互操作和可重用。

SciCrunch上托管的一个数据门户是研究资源标识符，或 RRID 简称为传送门。我是rrid的创始人之一，我认为我是他们最大的粉丝。这些简单的数字标识符类似于社会安全号码，但用于研究资源。他们告诉读者作者在他们的研究中使用了精确的细胞系或抗体。对于科学来说，这是第0步。确定研究的‘成分’清单，”Bandrowski解释道。“这些简单的数字之所以如此强大，是因为期刊开始需要它们，它们将细胞系等资源与存档和不断更新的信息联系起来。”

鉴定有问题的细胞系是一项非常耗费时间和精力的工作。国际细胞系认证委员会( ICLAC )为此目的而建立，并努力选择可用的最佳证据来确定哪些细胞系有问题。然而，ICLAC将信息放在电子表格上，因此作者必须记住它在哪里，并应该定期检查它。“我们都知道我们应该合理饮食和锻炼，但我们也并不总是这样做，”班德罗斯基博士解释道。“另一个问题是，研究人员一直在给细胞系命名，但由于有这么多细胞系，很难具体说出研究人员指的是哪一种细胞系。这有点像问“比尔·史密斯”是什么样的。哪个比尔·史密斯?”班德罗斯基提出了这个问题。ICLAC与Cellosaurus(细胞系rrid的权威来源)合作解决了这个问题。Cellosaurus为每个细胞系分配了一个RRID，它将包含该细胞系的完整“社会安全记录”，即所有已知的特征和潜在的标记，这些特征和标记可以更新。班德罗斯基博士惊呼道:“所以现在有问题的细胞系在Cellosaurus网站上的一个可搜索列表中被‘查出来了’。” “As journals started to require RRIDs, authors were confronted in a very immediate and direct way with critical information regarding the cell line used in their study, alerting them to any potential problem投稿前．这证明了持久唯一标识符(如rrid)的力量，”Bandrowski博士解释道。

随着在手稿中报告rrid越来越多地成为期刊的要求，它正在产生切实的积极影响，正如最近在一项研究中报道的那样 纸 班德罗斯基和她的团队。“我们对评估有问题的细胞系在研究中持续存在的程度感兴趣。当我们联系期刊编辑时，他们证实，他们很难让作者在验证他们使用的细胞系是否有问题时“脚在火上”，因为这是非常劳动密集型的。然后我查看了科学文献，发现一些非常好的研究，通过阅读几百篇论文来估计使用污染或有问题的细胞系的论文的百分比，或者使用PubMed搜索来估计有问题的细胞使用的论文的百分比。这些研究都不是决定性的。Cellosaurus和ICLAC证实，有问题的细胞系的使用仍在继续，”Bandrowski回忆起她论文发表前的早期事件。

“我的学生Zeljana非常兴奋，并敦促我们明确量化问题的范围。我的同事Ozyurt博士正在开发识别细胞系的代码。我们正在构建一个工具，帮助作者找出哪些rrid可以添加到他们的手稿中。在Zeljana的坚持下，我们将此代码用于PubMed Central的整个生物医学文献，并运行分类器代码来检测作者声明他们使用的细胞系的所有句子。这是一个困难的分析，但我们的发现确实令人兴奋。是的，根据200万篇调查论文，有问题的细胞系仍有8.6%的时间被使用。但我们发现，当作者使用rrid时，这个数字下降到3.3%。因此，rrid可以帮助研究人员避开有问题的线，”她兴奋地总结道。她对寻求有关问题细胞系资源的研究人员的最后建议是:“我认为ICLAC小组为科学家提供了很好的指导。他们花时间解释如何准确地检查细胞系的真实性。 I would differ slightly by adding: Please check your RRIDs before you start the experiment!”