CRISPR筛查:研究进化在培养皿中

CRISPR筛查允许快速和客观的识别一个特定的生物通路相关的基因。我们探索研究如何使用先进的工具来塑造我们理解生物学和医学的发展势头。

2012年,发明的CRISPR-Cas9基因组编辑技术在生物学标志着一个新时代——提供一个强大的新工具改变DNA精确,直接的方式。

“CRISPR-Cas9如剪切、复制和粘贴DNA,”解释道纳威娜,核心教员在纽约基因组中心和纽约大学的助理教授。“但是这种基因的量子飞跃编辑技术因其可编程性。能力计划Cas9去任何特定的地方在人类基因组中启用[使用]大规模筛查。”

CRISPR筛查——使用CRISPR-Cas系统编辑成千上万的基因和测量功能影响的编辑在一个实验——已迅速成为一个受欢迎的和富有成效的生物医学研究社区的工具。

“在过去的10年里,我们利用的能力CRISPR屏幕要撒一张大网的遗传假说,使用大网,查明基因负责许多不同的疾病和特征,“娜说。

无偏的广泛应用基于基因编辑筛选发现新的分子机制基础生物学,癌症研究、免疫学、神经科学和许多其他领域精密医学以及开放利用的机会。

CRISPR筛查是什么?

定期聚集空间短回文重复(CRISPR)相关蛋白9 (Cas9)系统由Cas9酶,形成DNA双链断裂,导游RNA,使核酸酶基因组中特定位置。当细胞试图修复损伤,它不完全,导致基因敲除。CRISPR筛查是一个应用程序的技术,其中包括巨大的慢病毒rna引到图书馆的大量人口的细胞。

“每个细胞都有一个不同的在不同的基因突变,从而能够研究基因组中删除每一个基因的影响在一个无偏和大规模并行方式,”描述了神采。

虽然基因敲除实验,完全灭活CRISPR目标基因是最常见的类型的屏幕,核心技术也已经适应了可以激活(CRISPRa)或沉默(CRISPRi)目标基因没有永久改变DNA。

“CRISPRa或CRISPRi使用突变Cas9和RNA指导目标启动子区域激活或抑制基因的表达,”解释道加布里埃尔Balmus英国老年痴呆症研究机构在剑桥大学的组长。

汇集CRISPR屏幕格式,有针对性的细胞是挑战与选择压力,比如药物治疗,随后评估通过分析测序数据,以确定基因的变化,有一个积极的还是消极的表型效应。结果通常是排名列表的基因赋予敏感性或抵抗特定生物挑战接受调查。最后一步是验证,任何观察表型变化是由于特定的突变的影响。

“我是一个超级粉丝汇集屏幕,因为他们提供了一个令人难以置信的强大的工具为研究而不需要复杂的实验室基础设施像机器人一样,“娜说。”,使其成为一个实验者进行可行的公司屏幕以相对简单的方式。”

相比之下,排列屏幕进行多井盘子,使研究者直接观察的影响个体指导rna在逐井的基础上。

”排列屏幕,它更容易识别一个特定突变的影响你使用CRISPR介绍,”状态埃琳娜·纳瓦罗格雷罗州功能基因组学主管目标发现牛津大学的研究所。“但是他们比池屏幕更昂贵和耗时的。”

因为每个突变是预定义的,排列屏幕也更容易结合家里,不涉及DNA测序,如成像,蛋白质组学和代谢组学分析。但是最近的进步单细胞multiomics是获得高含量家里打开新的可能性,如基因表达或表观遗传状态,描述单个细胞从池CRISPR屏幕以前所未有的细节。

识别基因先天免疫的司机使用自定义目标CRISPR屏幕

下载这个应用程序报告发现人员能够生产高质量、定制的寡核苷酸CRISPR屏幕,确定一个数量的基因影响人类单核细胞吞噬作用,避免与验证相关的成本和时间影响冲击所产生的全基因组屏幕。

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从基因治疗

潜力最大的地区之一治疗医学CRISPR筛查的应用精度。确定哪些基因增强或减少特定药物的活动打开了患者在治疗的机会。

的第一个公司CRISPR屏幕出版于2014年,展示了承诺的方法识别癌细胞突变带来的耐药性。池的屏幕,这与64751年目标18080个基因独特的引导序列在黑色素瘤模型,确定候选基因的参与vemurafenib阻力损失,存在BRAF突变蛋白激酶的药物目标。从这些研究结果将铺平了道路,更详细的遗传分析病人的肿瘤帮助预测是否将受益于一个特定的治疗。

“CRISPR屏幕,我们可以实现个性化医疗的承诺和做出正确的治疗决策。这就像一个查找表的基因型—也就是说,特定突变——每个突变被连接到一个特定的生物表型,”娜说。

CRISPR筛查也可以用来探索基因组的非编码区域的变化的影响。2015年,佳娜是一个团队的一部分使用CRISPR指南库用来询问有针对性的突变的影响BCL11A红色的增强剂,非编码基因元素参与控制胎儿血红蛋白的表达。

”其推测很长一段时间,重新激活胎儿的血红蛋白,通常关闭在成人中,可以提供一个替代某些血液疾病患者的成人版本影响成人ß-hemoglobin,生产的“娜说。

2021年的结果临床试验的治疗针对基因编辑BCL11A增强器发表。两个病人——一个与ß-thalassemia以及其他与镰状细胞性贫血,收到他们的血液的注入干细胞基因编辑重新激活胎儿血红蛋白的生产。一年多以后,都有高水平的胎儿血红蛋白表达和不再需要接受输血。

“CRISPR指南RNA用于临床试验出来的图书馆我们设计我们的屏幕,“娜说。“这是一个很好的例子,真的

证明了这种方法的力量。”

加速目标验证治疗工程细胞库

下载这个案例研究学习使用工程细胞库中的病毒-宿主相互作用的研究中,基因工程的发展从CRISPR击倒屏幕,屏幕和数据和下游化验显示功能和临床相关性验证的目标。

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克服挑战

而传统的永生化细胞系上执行CRISPR屏幕相对简单,可以进行类似的研究更具挑战性其他类型的细胞。

“最大的限制是需要大量的细胞——特别是对于池屏幕,你需要至少有70到1亿个细胞——这可以是一个真正的问题,当你使用有限的患者样本,”纳瓦罗Guerrero说。“另一个问题是,一些细胞类型,如巨噬细胞或神经元——很难与慢病毒感染。”

克服这些挑战,许多研究人员正在使用诱导多能干细胞(iPSC),这可能代表更相关patient-derived模型研究人类疾病。例如,纳瓦罗格雷罗州的团队最近开发出一种慢病毒转导的交付方法CRISPR / Cas9巨噬细胞来源于人类iPSC,效率接近100%。

“这打开了令人兴奋的新机会研究巨噬细胞在免疫反应的作用,慢性炎症,神经退行性疾病和癌症进展,使用高效的基因组编辑技术,“纳瓦罗Guerrero说。

研究神经退行性疾病也需要找到方法来模拟细胞衰老的影响——使筛查表型相关疾病的病理变化。例如,Balmus的团队使用CRISPR筛查探索Ataxia-telangiectasia背后的潜在疾病的机制,一种罕见的遗传性神经退行性条件由突变引起的自动取款机基因,让细胞活性氧加速老化的过程。

“我们发现转录因子基因,当失去时,救援的敏感性自动取款机缺乏细胞活性氧,”Balmus说。“我们认为这种基因是高度相关的疾病表型,因为它通常表示只有在特定类型的神经元死亡的病人。”

选择正确的CRISPR系统为您的研究

的应用CRISPR基因编辑技术正在不断扩大。CRISPR系统的多功能性的来自CRISPR-associated蛋白质或Cas蛋白质、分子剪刀,识别和降低特定的DNA片段。下载这个程序注意发现Cas9和Cas12之间的主要差异是什么,什么是适合你的研究。

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发现“未知的未知”

CRISPR筛查是使研究人员能够快速识别特定基因变化与特定的生物通路或相关疾病——在一个完全公正的方式。

“这是一个工具,它允许您执行在培养皿中进化,“Balmus说。“我们正在进行的一些研究非常违反直觉的;没有办法我们可以提前预测他们。”

技术为研究人员提供了一个强大的工具来询问各种生物问题——如解剖疾病或识别基因变化的根本原因,给予药物敏感性或耐药性。

“我喜欢工作在这一领域,它可以让你感到惊讶,”娜说。“发现你的感觉从这些高通量功能基因组屏幕是惊人的,你可以每天走进新的生物学。”