CRISPR /中科院是一种基因编辑技术,最近被一个吗2020年诺贝尔化学奖授予Emmanuelle贝纳和詹妮弗Doudna。CRISPR /中科院目前与激动人心的医学应用;然而,研究CRISPR / ca开始作为一个细菌的免疫防御系统裂开病毒DNA。贝纳和Doudna意识到CRISPR / ca可以作为一个基因组重新编辑工具由于其目标特定DNA序列的能力。
在其规范形式,CRISPR /中科院由CRISPR, RNA指导分子目标感兴趣的基因碱基配对,包裹着一个ca酶-通常Cas9劈开目标序列的蛋白质分子,即。,生成一个双链断裂。一旦裂解目标序列,一个不完整的修复会导致删除或DNA碱基的随机插入到目标基因灭活。如果一个互补链的基因存在,修复可能导致目标基因插入。这项技术已经被修改,以执行更控制修改只攻击目标DNA,即。,打破了一个链。随后,CRISPR / Cas-conjugated基本编辑器执行单碱基变化到目标基因而'编辑导致更复杂的变化,如小的插入、删除和替换。
CRISPR /中科院相对快速,成本效益和效率。这是极其多才多艺的,也可以编辑在多个基因组生物模型,包括细菌,飞,蠕虫,啮齿动物,非人灵长类动物和人类。操作可以执行细胞,但越来越多的在活的有机体内应用程序也可行的选项。
CRISPR / ca:安全性研究,谢谢!
CRISPR / Cas迅速发展以来最早的应用程序作为一个基因组编辑工具。虽然它不是常规临床使用,临床试验正在和一些患者已经收到CRISPR / Cas-edited细胞,例如,治疗吗β-thalassemia镰状细胞病和有限的类型的癌症。鉴于其即将搬到诊所,评估CRISPR /中科院1 安全2是一个活跃的研究领域。
“以前的基因组的方法修改,如病毒插入,随机整合到基因组。相比之下,CRISPR / Cas是针对一个特定的轨迹,CRISPR指导RNA碱基配对的感兴趣的基因。然而,基因组数十亿基地和CRISPR / Cas是用来编辑数以十亿计的细胞,所以它仍然是有可能的错误发生,”解释道凯尔克罗默外科学系助理教授,加州大学旧金山。“这些错误,可以“目标”,这意味着它们发生在所需的位置,但不正确的编辑,也可以是“偏离”,这意味着错误发生在一个除了目标轨迹。”
评估这些错误是至关重要的,因为他们可以导致各种不良和对病人潜在的危险后果,比如截断或错义与有毒蛋白质功能丧失或功能或破坏肿瘤抑制基因或激活癌基因。
非目标可能出现的错误,因为CRISPR指南RNA可以near-match配对与一段DNA位点以外的目标基因由于数十亿基地基因组中。“有几个方法来评估潜在的脱靶效应,计算在网上等方法和实验在体外颗粒以及在cellulo解释说:“罗伯特·Chiarle病理学系教授,波士顿儿童医院和哈佛医学院。“这些方法的优点和缺点各不相同。例如,尽管脱细胞方法快,他们识别和伪非目标网站在cellulo直接进入细胞方法,介绍了中科院。”简历道,博士后Chiarle病理学系,波士顿儿童医院和哈佛医学院了。
最终,CRISPR / Cas前往诊所,有必要全面评估其安全。“如果CRISPR / Cas是成为标准的照顾基因组编辑,底线是,我们需要全面评估其安全,”克罗默表示。“目前,只有少数的病人收到CRISPR / Cas-edited细胞。但如果技术将进入更多的人,意外事件的发生可能还会上升。”
CRISPR / ca:通过深度测序质量控制
克罗默感兴趣评估CRISPR / Cas的安全性和有效性,包括patient-derived细胞。“我们最近的表现深度测序3主要的人类造血干细胞和祖细胞(公司)从三个捐助者(同意)后CRISPR / Cas编辑实验剖面不相干的事件,”克罗默表示。这个实验是很重要的,因为克罗默patient-derived细胞用作测试安全与临床相关的上下文永生化细胞,它可以影响非目标频率。此外,公司可编辑CRISPR / Cas在血液血红蛋白突变的潜在治疗疾病,如β-thalassemia和镰状细胞性贫血。
该研究使用超深测序检测极其罕见突变后从脱靶效应在523年癌症相关基因CRISPR / Cas与RNA编辑指南针对3基因。CRISPR指南RNA基因的目标也有预测脱靶的网站,是一个积极的控制。“我们发现CRISPR /中科院没有造成脱靶效应在任何的癌症相关基因测试,”克罗默总结。“重要的是,一个单核苷酸多态性(SNP)在目标DNA,只有一个意义不同的基地,防止不相干的活动指南RNA CRISPR / Cas-modified公司。”
除了验证CRISPR / Cas的特异性,研究有重要临床意义自然遗传变异存在于人类的人口。“CRISPR指南RNA设计使用一个共识的人类基因组序列。然而,自然的不同个体的遗传多样性意味着他们可能有单核苷酸多态性,即。,单个DNA碱基差异,在感兴趣的基因。我们的结果表明,甚至单个碱基的不同可以改变的可能性CRISPR编辑目标基因的病人。这意味着我们需要考虑自然遗传变异性,如果CRISPR / Cas是进入诊所,可能通过测序病人的基因snp的兴趣。”
帮助1号线:反转位子活动在CRISPR / Cas断裂
Chiarle和陶也评估CRISPR / Cas的安全。他们的兴趣等项目,位于反转位子活动的集成在CRISPR / Cas休息,他们检查最近的一篇论文。4反转位子活动构成威胁,因为他们可以插入关键基因,如肿瘤抑制,他们才会安静下来。“我们第一次使用规范CRISPR / Cas,产生双链断裂编辑相关基因。我们设计CRISPR RNA指南的目标基因在三细胞模型,包括MYC(一个著名的致癌基因),CCR5(艾滋病毒感染的主要coreceptor)和RAG1,这有助于重组V(变量),D(多样性)和J(加入)- VDJ域的抗体增加多样性)。然后我们监控逆转录转座子的插入名为长点缀元素1(1号线)、“道阐述了实验设计。“我们发现,1号线插入是不可取的结果与规范CRISPR / Cas编辑使用双边带。我们没有正式证明的生理后果1号线插入我们的论文;然而,他们可能构成安全风险通过灭活重要基因或随后的染色体的修改。”
这项研究还测试了1号线的频率逆转录转座子插入基因组改造后使用基地或'编辑利用CRISPR / Cas系统,只有尼克目标生成单链DNA断裂。“我们发现,1号线插入目标基因编辑时少使用基地或编辑,“Chiarle描述。“这些结果的观察是一致的基础和主要编辑导致更少的质粒和基因插入和表明,新一代的CRISPR / ca工具可能更安全使用比规范CRISPR / Cas患者。”
虽然基础和主要编辑器通常用于研究实验室,他们是相对较新,仍在临床的早期阶段管道。”事实上,临床试验更经常使用规范CRISPR / Cas,”陶说状态的字段。“因此,我们的研究结果表明,一个额外的安全层检查1号线和其它逆转录转座子插入应该添加充分评估CRISPR / Cas编辑系统的安全,特别是在试验使用规范CRISPR / ca而不是基础和主要编辑系统。”
CRISPR / ca安全:前方的道路
虽然研究已经取得了重大进展在评估CRISPR / ca安全还有许多杰出的问题和关切。
克罗默指出,无意的染色体变化后CRISPR / Cas编辑是一个重要的问题。“我们看到CRISPR /中科院基因组编辑非常有效,这是精确的基因座具体的变化。然而,CRISPR / Cas削减会引起大混乱,难以识别,如大型缺失、易位和chromothripsis(染色体粉碎)。这些可能发生的结果目标编辑或重复切割。“Chiarle和道表达了类似的担忧。“反转位子活动,如第1行,插入CRISPR / Cas-generated双链断裂,可能导致复杂基因重组。当然,双链断裂从CRISPR / Cas本身,也可以引起大基因组的改变。”
此外,在活的有机体内编辑在病人也在地平线上。“我们将需要额外的安全测试如果我们正在CRISPR / ca在活的有机体内目前的轨迹,”克罗默警告。“这已经很难评估质量控制CRISPR /中科院细胞内编辑,执行它在活的有机体内是难上加难。除了考虑目标和非目标事件的基因组,在活的有机体内安全评估还需要考虑对组织和off-tissue事件,即。,CRISPR / Cas代理是否有意或无意的组织。”
Chiarle和道未来的挑战包括:什么“CRISPR / ca诊所,我们将需要考虑的方法在活的有机体内交付,治疗的好处,和编辑效率、精度、和特异性等障碍可能发生。关于安全在活的有机体内、精密和特异性将是特别重要的,尽管这些很难解决目前由于缺乏模型来评估这个准确。监测试验参与者将是关键,但是这是有限的可访问性组织。”
克罗默说,他认为合成生物学将在一个非常重要的角色在CRISPR / Cas的未来:“我们可以工程师有效载荷更精确的交货。我们也可以使CRISPR / Cas编辑安全也引入诱导安全开关,这可能是激活细胞清除编辑的一个不良事件。CRISPR /中科院发展迅速,我们需要发展安全机制来保持同步,”他说。
引用
1。Wienert B,克罗默可CRISPR核酸酶日常活动和缓解策略。前基因组艾德。2022;4:1050507。doi:10.3389 / fgeed.2022.1050507
2。道J,鲍尔DE Chiarle r的安全评估和推进CRISPR-Cas工具:从DNA, RNA编辑。Nat Commun。2023年1月13日,14 (1):212。doi:10.1038 / s41467 - 023 - 35886 - 6
3所示。克罗默可Barsan VV, Jaeger E, et al。超深测序验证安全CRISPR / Cas9基因组编辑在人类造血干细胞和祖细胞。Nat Commun。2022年8月11日,13 (1):4724。doi:10.1038 / s41467 - 022 - 32233 - z
4所示。道J,王Q, Mendez-Dorantes C,伯恩斯KH Chiarle r 1号线的频率和机制逆转录转座子插入在CRISPR / Cas9网站。Nat Commun。2022年6月27日,13 (1):3685。doi:10.1038 / s41467 - 022 - 31322 - 3
