高含量、高通量筛选的多样化应用

多年来，关于_______的相对优点有很多争论表型筛选与靶向筛选．然而，学术界和工业界的研究人员很可能会同意，筛选技术的最佳选择在很大程度上取决于你试图回答的问题。

以目前给人类带来巨大负担的两个对手为例:COVID-19和癌症。全球立即努力寻找有效对抗SARS-CoV-2(导致COVID-19的病毒)的药物或疫苗，这需要一个完全不同的这是一套治疗癌症等复杂疾病的工具。在这篇文章中，我们用这两个例子来说明我们今天手头上的筛选工具的范围。

COVID-19药物发现的虚拟筛选

目前，全球大量研究工作集中在了解SARS-CoV-2病毒，以开发治疗方法，或者理想情况下，开发疫苗。然而，今年早些时候，由于疫情爆发，实验室的进出受到限制，香港理工大学的陈宇伟(Yu Wai Chen)和他的同事们需要依靠基于计算机的筛查来快速找到对抗病毒的潜在药物。¹

Chen解释说:“我们利用针对2003年SARS爆发的大量药物研究，开始寻找可以立即应用的基于结构的治疗方案。”“使用虚拟筛选可以避免冗长的蛋白质生产和纯化，从而加速这一过程。”随着SARS- cov -2基因组序列的发布，它与之前的SARS冠状病毒的密切关系被揭示出来，而且由于病毒具有高度的蛋白质序列相似性，该团队对他们预测模型的质量有信心。

他们把精力集中在病毒蛋白质，3c样蛋白酶(3CL^箴)，这是复制所必需的。“我们基于其与SARS-CoV同源物的高序列相似性(94%的同源性)预测了其3D结构，但最大的挑战是对那些“突变”(变体)残基的侧链构象进行建模。目前，还没有自动化建模软件能令人满意地做到这一点。”在一轮侧链建模之后，他们检查并修改了a链和B链的每个变异残基，参考了蛋白质数据库中模板结构的电子密度。“我们知道这些变异残基在底物结合或催化中没有发挥关键作用;然而，我们不遗余力地在每个位置制造出最可能的旋转器的最佳模型。”

该团队专门选择了已经获得监管机构批准用于其他适应症的药物作为候选药物，因为其目标是推荐可以尽快应用的治疗方案。2月中旬，他们发表并推荐了16种用于重新利用抗COVID-19的候选药物。陈说:“在这些药物中，抗病毒药物ledipasvir或velpatasvir(最初是抗丙型肝炎病毒药物)特别有吸引力，副作用最小。”“然而，我们也注意到，药物Epclusa (velpatasvir/sofosbuvir)和Harvoni (ledipasvir/sofosbuvir)可能非常有效，因为它们可能对两种病毒酶具有双重抑制作用。使用具有两个靶点的药物可能会大大降低病毒产生耐药性的可能性。”

为了确认计算结果，下一步是执行在体外研究。“我们现在计划研究我们提出的候选人对3CL的结合和抑制的强度^箴用结构研究来验证蛋白质的结合。如果这些生化筛选研究取得积极结果，那么我们将在细胞和动物模型中研究病毒的抑制作用。希望这些结果足以说服临床医生，这些候选药物值得进一步测试。”

COVID-19结合表位的最新研究

世界卫生组织宣布新型冠状病毒COVID-19为全球大流行。随着它的传播，研究人员正在动员起来了解病毒的结合机制，作为开发疫苗的第一步。在本应用说明中，发现生物层干涉测量法和生物传感器技术如何促进COVID-19疫苗开发的现实例子，使研究人员能够评估病毒-抗体相互作用的特征。

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复杂生物学的高含量筛选

与之相对的是，在危急时刻单靶标蛋白，我们筛选药物对抗的许多复杂疾病需要更广泛的细胞或组织表型。这导致了向高含量筛查的重大转变。

在英国诺丁汉大学，Tim Self领导SLIM成像设备，并发现对高含量成像的需求不断增长。“多年来，我们专注于高通量屏幕，将第二信使信号强度作为简单的读数。如今，我们可以在不同波长的光线下拍摄井的多个视图，并在细胞内标记不同的目标。事实上，这是可能的，因为有几个关键的进展。”

大多数高含量成像平台使用荧光，过去大多是宽视场系统(即不是共聚焦显微镜)。赛尔夫解释说，除了改进的相机技术提高了图像采集的质量、速度和灵敏度外，主要的进步之一是led的创新，这样你就可以有多个激励通道。“它们为多波长实验提供了更多的激发功率和更快的开关，并且使用起来更便宜。但它们仍然没有激光那么强大——激光仍然是许多高端成像平台的关键组件。如果你有一个带有激光的旋转光盘(盒子1)，这可以让你快速、温和地获取图像，避免漂白样品并损坏它。”

探针的范围也在荧光中不断增加，而以前这落后于技术发展。赛尔夫解释说:“还有很多更聪明的探针，它们会根据所处的环境或放置的光源改变荧光。”“但我们正在研究的另一个领域是活细胞的无标签成像。这包括拍摄细胞群的高质量相位对比图像，以便在它们增殖和迁移时跟踪它们，”Self解释说。这已被用于研究伤口愈合，在划伤实验中，或通过在孔内放置间隔物，移除它们，并跟踪增殖细胞进入该区域。

高含量成像的一个大趋势是向3D和4D培养细胞所以要观察更厚的样本，并随着时间的推移进行研究。Self说:“以前我们只能研究单层培养细胞，但现在我们想要更深入地研究样本——例如，如果我们研究球体或生物膜——平板阅读器现在能够更准确地完成这一工作，并在事后重建数据。”

高含量筛选数据的重建

这给我们带来了高含量筛选中最重要的进步——成功分析所有数据所需的计算能力。Steven Bagley的实验室在柴郡阿尔德里公园的英国癌症研究所曼彻斯特研究所进行的工作很好地说明了这一点，他们负责为45-50个研究小组筛选转化样本(例如患者样本或异种移植)，其中许多研究小组现在希望对3D样本进行高含量成像而且在不同的生理条件下。

“大约从2008年开始，我的任务就是尽可能简单地为研究所内的团队用数字描述数据。我们挣扎了很长一段时间，因为当时没有太多工具可以进行高含量的3D和4D分析。”Bagley解释道，尽管计算能力有所提高，可用的分析工具也越来越多，但大多数用于3D分析的软件包往往难以对所有油田的所有井进行批量分析，并将所有数据连接起来。

“如果你认为一个96孔由25个视场组成，我们想要将所有这些3D拼接在一起，然后对该体积进行分析……计算，这变得非常困难，特别是当可能有4个荧光通道时。在60口井和30个板块中进行这项工作是一个大问题。”

他们与该研究所的计算科学家正在探索的一件事是开发一个可以进行表型分析的人工智能(AI)平台。在诺丁汉大学，他们也对这种方法的潜力感到兴奋。赛尔夫说:“机器学习和向人工智能的发展，使你可以训练你的软件寻找某些特征，这有可能为我们所能做的事情提供巨大的进步。”

使用高含量成像的一个明显优势是，它消除了传统显微镜带来的用户偏见。“当我教学生的时候，我说高内容筛选之所以这么好，是因为它消除了用户的偏见，如果你在幻灯片中亲自选择区域，因为你看到了符合你正在寻找的形态的单元格，”Self说。巴格利也认为，在癌症研究中尤其如此肿瘤微环境．“通常是碎片细胞和那些不漂亮的细胞会给你更多的信息。这就是为什么我们需要在三维空间中捕捉所有的细胞以及随着时间的推移。在研究免疫疗法等治疗方法时，不仅是在3D中生长的肿瘤细胞，而且它们周围的细胞也很重要。”

随着研究人员转向高含量筛选，另一个自然发生的变化是通量。“我们没有选择所谓的高含量数据的“耕种”，也没有做384个和1000多个孔板，我们倾向于保持在96个以下，因为我们需要生长空间和时间让细胞相互作用。一些图像使用低倍率镜头扫描患者细胞，寻找循环肿瘤细胞，可以在20或30分钟内从60个孔中获得图像。在其他情况下，要求下入48口井因为一些球体和瀑样我们长得相当大。”在这些情况下，机械臂和自动孵化器可以在5到6天内对多个板进行快速分析，并使研究人员能够对药物或类器官发育等过程进行成像。Bagley解释道:“我们不希望只看到一个小的时间快照或开始或结束，我们希望看到最终产品的所有单独阶段。

先进的流式细胞术-复杂细胞模型的快速分析

我们对细胞生物学和分析技术的理解的进步导致了在药物发现工作流程中更早地使用基于细胞的分析。这给实验室带来了重大挑战;传统的基于细胞的方法不是为早期候选识别的高通量筛选需求而设计的。因此，实验室需要找到新的工作方式来应对现代药物研发管道的需求。下载本白皮书以发现一种快速、高通量的细胞筛选分析解决方案。

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未来的需求

巴格利说，市场的缺口在于，要让尽可能多的品牌多元化。“目前我们只能使用四到五种颜色。我们的大多数样本都很珍贵，对我们来说，尽可能多地获得标签并提出复杂的共定位问题是很重要的。现在，没有足够的标签或激光来填充调色板。我们正在探索是否可以通过替代技术、更好的过滤或不同的数据收集方式来解决这个问题。最终，我们的样本来自患者，所以我们希望充分利用它们。”

参考

1. 陈耀文、姚立斌及王永基。(2020)。SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 3C-like蛋白酶(3CL pro)结构预测:虚拟筛选显示velpatasvir、ledipasvir和其他药物再利用候选药物。F1000Res。DOI: 10.12688 / f1000research.22457.2。eCollection 2020。