RNAi筛选趋势
简介
rna介导的干扰(RNAi)是序列特异性基因敲除的标准工具，通常与表型变化相关，并可导致生物学途径的未知成分的识别。RNAi已经存在了大约10年，能够针对人类基因组进行高通量功能丧失筛查。在进行RNAi筛选之前，未来的研究人员需要做出一些决定。其中包括决定是单独筛选目标(所谓的“阵列”方法)还是进行聚合RNAi筛选;选择是筛选全基因组还是专注于已经注释的基因家族的子集(例如靶类特异性);并确定最佳的实验系统和筛选类型，以回答感兴趣的生物学问题。一些技术方面的考虑包括RNAi传递的方法和端点监测，以稳定、可靠和高通量的形式检测所需的表型。RNAi筛选器还需要了解聚类规则间隔回文重复序列(CRISPR)技术的最新发展，因为在某些情况下，CRISPR方法可能比RNAi更适合进行基因组编辑。
2014年10月，HTStec在学术界、制药和生物技术的研究实验室中进行了一项关于RNA干扰(RNAi)筛选和基因沉默的市场调查。主要目标是全面记录RNAi筛选的当前实践和偏好，并了解未来的用户需求。本文包含HTStec市场报告“RNA干扰筛选趋势2014”的“精选结果”。它旨在为读者提供对最近市场趋势的简要洞察。它只涵盖了完整报告中详细列出的30个原始问题中的10个。应查阅完整的已发表报告，以查看整个数据集、对每个问题的回答的细分细节、其分割和对未来的估计。请点击这里获取更多信息。
RNAi筛选目标疾病区域:
RNAi筛选试验最靶向的关键疾病或研究领域如图1所示。这表明肿瘤/癌症领域的靶向性最强(63%靶向)。其次是免疫/炎症疾病/自身免疫(33%靶向);传染病(31%的目标);然后是神经病学/中枢神经系统/神经退行性变/疼痛和代谢疾病/糖尿病(都有24%的目标)。
图1 RNAi筛选分析的重点疾病或研究领域
进行RNAi筛选时的分析偏好:
RNAi筛选分析的主要应用领域见图2。这表明，新的治疗靶点的识别是RNAi筛查的主要应用(57%的应用)。其次是无偏倚筛选，以识别调节各种细胞生物过程的基因(47%应用);筛选识别信号通路/级联的新部分(45%应用);然后筛选确定调控癌症的基因(41%的人申请)。最不感兴趣的是RNAi治疗技术的发展(只有20%的应用)。
图2 RNAi文库筛选的主要应用领域
图3给出了两种主要的RNAi筛选方法的使用情况。即1)以单个基因为目标的每种独特RNAi试剂或独特试剂组(如针对一个基因的一小群独立sirna)的排列，在微量滴度板(如384孔板)中占据一个独特的孔;2)混合，将所有基因特异性试剂混合在一起，或大量合成，并随机添加到细胞中。这表明，受访者主要使用数组方法(46%的人更喜欢)，或者他们同时使用数组方法和汇总方法(42%的人更喜欢)，只有13%的人主要喜欢汇总方法。
图3 RNAi筛选的首选方法
目前(2014年)研究的主要RNAi屏幕类型如图4所示。这表明，调查最多的是功能筛选的丢失——基于表型的减少或丢失(65%使用)。紧随其后的是功能筛选的缺失——基于表型的增强(54%使用);然后合成致命筛选-基于双重敲除或平行敲除细胞系来创建合成致命性(28%使用)。CRISPR可逆敲除的使用目前仅限于少数受访者(7%使用)。
图4 目前研究的主要RNAi筛选类型(2014)
图5报告了在进行RNAi筛选时监测的主要终点(读数)。这表明，基于平板阅读器的全细胞反应监测(例如，活力，细胞增殖)或表型标记物/细胞参数的高含量显微成像是使用最多的终点(均为62%使用)。然后用qRT-PCR定量mRNA(40%使用);基于平板阅读器的细胞成像结合全细胞反应的批量监测(21%使用);然后用高含量激光扫描细胞仪检测表型标记/细胞参数(19%使用)。
图5 进行RNAi筛选时监测的主要终点
siRNA文库筛选的转染方法:
目前(2014年)用于siRNA文库筛选最常用的传递(转染)方法见图6。这表明标准化学(脂质介导的)转染是最常用的。然后进行反转染，再进行无脂转染。目前使用最少的是电穿孔和病毒转染。
图6 目前在siRNA文库筛选中最常用的递送(转染)方法
RNAi文库筛选:
图7中报告了供应商编译的调查受访者最感兴趣的RNAi库。这表明覆盖人类基因组的RNAi文库是最感兴趣的(33%的人更喜欢)。其次是目标类特定文库，如激酶、蛋白酶、GPCR、离子通道等(28%倾向)，然后是途径分析特异性(20%倾向)。
图7 供应商编译了受访者最感兴趣的RNAi库
RNAi筛选的最大挑战:
目前最限制受访者RNAi筛选工作的因素如图8所示。这表明，脱靶效应是最具限制性的。这紧随其后的是击倒水平;敲除不会产生强大的表型变化;然后是屏后分析方法/反褶积。限制最少的是不适当的控制策略。
图8 当今最限制受访者RNAi筛选工作的是什么
供应商在提供RNAi筛选试剂方面的意识:
被调查者首先想到的RNAi筛选试剂和耗材的供应商/供应商如图9所示。这表明Thermo Scientific/Life Technologies是最受认可的RNAi筛选试剂和耗材供应商(38%的人选择)。其次是GE Dharmacon(26%选择);Sigma Aldrich/Proligo(13%选择);Qiagen(8%选择);然后是EMD-Millipore(5%选择)。其他所有人的选择加起来不到所有选择的10%。请注意，这不应被视为一个真实的市场份额预测。调查对象首先想到的是RNAi筛选试剂和耗材的供应商，这可能与他们购买耗材最多的供应商不一样。
图9 RNAi筛选试剂和消耗品的供应商/供应商
首选基因沉默方法:
CRISPR-Cas9细菌免疫系统可以被重新利用，轻松地在哺乳动物基因组中进行删除、插入和替换，这一发现有可能彻底改变基因组工程领域，并重振基因治疗领域。当CRISPR在目标基因中引入的DNA断裂的修复过程中发生错误时，它会破坏基因。RNAi以一种非常不同的方式破坏基因功能，它通过诱导基因目标转录本的快速降解来干扰基因的翻译。因此，RNAi可能比CRISPR更适合用于验证新的药物靶点，因为小分子药物只会像RNAi那样在一定程度上降低基因的功能，而不是像CRISPR那样完全将其摧毁。目前，人们对使用CRISPR作为RNAi基因沉默的替代方法非常感兴趣。考虑到这一点，调查对象被问及，基于他们现有的知识，就用于基因沉默的技术的期望属性列表而言，他们目前认为哪种方法是最有利的。这些结果如图10所示。这表明，RNAi方法在易用性、广泛适用性、实验周期短和成本效益方面被大多数受访者认为更有优势。相比之下，CRISPR方法被认为仅在特异性方面更可取;结果具有良好的可解释性。
图10 基因沉默方法(RNAi vs . CRISPR)被认为在理想的技术属性方面最有优势
这些发现与试剂提供者提出的CRISPR的一些优点并不一致，这表明需要做更多的工作来阐明CRISPR与RNAi的优点。
结论:
上述报告的选定结果表明，肿瘤/癌症是RNAi筛查试验最靶向的疾病或研究领域。RNAi筛选分析的主要应用领域是识别新的治疗靶点。目前进行的大多数RNAi筛选涉及一种阵列方法，其中每种独特的RNAi试剂或针对单个基因的独特试剂组(例如针对一个基因的独立sirna的小池)在微量滴度板中占据一个独特的孔。目前研究的主要RNAi筛选类型是基于表型减少或丢失或基于表型增强的功能丧失筛选。进行RNAi筛选时监测的主要终点(读数)是基于平板阅读器的全细胞反应监测，如活力、细胞增殖或表型标记物/细胞参数的高含量显微成像。目前最常用的siRNA文库筛选的传递(转染)方法是标准的化学转染(即脂质介导的)。供应商编译的RNAi库最感兴趣的调查受访者是那些覆盖整个人类基因组。
这些选定的发现也证实了当今RNAi筛选的最大挑战之一是脱靶效应，即大多数siRNAs不仅靶向它们的互补靶基因，而且还解除了未知数量的脱靶基因的调控。这些脱靶效应是每个siRNA的序列特异性和固有的。尽管在减少脱靶效应方面已经取得了一些进展，但大多数可用的RNAi试剂还不能提供令人满意的保护。siTOOls生物技术公司的一些新的sipool可以在这方面提供希望。
受访者首先想到的RNAi筛选试剂和耗材的供应商/供应商是Thermo Scientific/Life Technologies、GE Dharmacon和Sigma Aldrich/Proligo。这三家供应商都处于提供最广泛的基因编辑技术(包括CRISPR-Cas9系统)的最前沿。
受访者目前认为RNAi方法在技术上比CRISPR更易于使用;广泛的适用性;实验周转时间短;以及成本效益，而CRISPR干扰方法仅在特异性方面被认为是可取的;结果具有良好的可解释性。最近的研究结果表明，RNAi和CRISPR-Cas9系统是互补的技术，具有良好的重叠性，可以用来验证彼此的结果。有了这两种技术，研究人员现在有了一个令人印象深刻的工具箱来阐明基因功能，并能够更好地了解与药物发现有关的基因组。
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