未来的PCR诊断方法

诺贝尔奖获得者聚合酶链反应(PCR)¹技术彻底改变了分子生物学在其发明于1986年,它所做的相同的医学诊断在过去15年。能够复制和繁殖特定目标DNA分子已经打开门跨多个领域快速诊断疾病,准确,以较低的成本随着时间的推移。

PCR创造无限的DNA复制使用聚合酶,从只有一个原始链引物(小的DNA序列,确定DNA被放大)和多个热循环。进步是在1980年代使用的细菌酶能够承受高温和1991年技术被制药巨头罗氏收购,开始提炼科学用于医疗诊断。

PCR的优点

当前(文化)方法可以很辛苦,有时会持续数天到数周,而定量PCR方法在数小时内可以给你答案。它可以更快和更健壮,丽贝卡·桑德斯说,核酸计量从LGC科学家,特丁顿,英国。PCR诊断更快和更少的倾向于交叉污染,因为技术通常是自动进行热循环。这也是更敏感,更具体比plate-based免疫测定。

在某些情况下,PCR诊断的首选方法。例如,方法得到世界卫生组织(世卫组织)的快速诊断肺结核(TB)²更换标准痰涂片镜检法开发一个多世纪。PCR和核酸扩增试验(NAATs)给快速的结果,这是允许早期结核病诊断的现场使用——重要的防止疾病蔓延。

PCR诊断的潜力是巨大的。”会更容易定义PCR不会使用——一切都在这个星球上有一个DNA或RNA基因组如果你想检测你去PCR,”解释了乔纳森·O ' halloran QuantumDx首席科学官在英国纽卡斯尔,基于PCR诊断启动。他补充说,以及临床应用PCR诊断方法也可能成为重要的粮食和农业等行业的竞争。PCR诊断方法的另一个优点是使用多路复用化验-多个目标在单一PCR的扩增实验通过使用多个引物对。这可能是有用的在诊断感染症状并不容易的特点。20病原体可以在一个测试覆盖。³

伦敦首席执行官阿伦·科恩的诊断。艾未未说,当前的PCR诊断生态系统目前由实验室测试,“目前很少有FDA批准的测试,也许10个不同的化验有FDA批准(如艾滋病毒)和完全自动化,但对于绝大多数,检验科已经得到了人们的依赖。

qPCR领导的方式

大多数的诊断将基于实时定量PCR (qPCR)。⁴它通过使用荧光标记寡核苷酸探针和监控每个周期后的荧光信号的强度反映了DNA扩增的数量和周期的荧光的数量首次检测到被用来计算初始样本的DNA分子,一旦系统校准。

分子诊断重要性的认识,早期诊断的威胁生命的感染,力量最近推出实时pcr侵袭性真菌病。Fungiplex®曲霉菌和Fungiplex®念珠菌检测曲霉属真菌和假丝酵母直接从患者样本DNA分别允许侵入性疾病的早期诊断,而不等待真菌病原体的文化。有针对性的抗真菌药物治疗可以规定早期改善患者的结果。

qPCR也适应检测RNA病毒如艾滋病和丙型肝炎和RNA转录分析与一些癌症相关。在两步逆转录聚合酶链反应(rt - PCR), RNA分子转化为它们的互补DNA(互补)序列逆转录酶酶放大的cDNA标准PCR紧随其后。一个新的超高速可以承诺一个更有效的方法在发展过程中,尤其是在分析大量样品。方法利用转基因耐热性的逆转录酶PCR过程可以直接从RNA进行。⁵

克服的局限性

与PCR诊断相关但也有局限性,“与PCR的所有关于你的样品制备,与immuno-diagnostics本质上,您可以使用一个原始血清血液样本,PCR诊断需要你做一些具有挑战性的样品制备,”O ' halloran说。许多有机和无机物质会抑制PCR所以他们必须清除,这些额外的阶段使过程更加复杂。

许多公司和学术团体正在看技术来提高PCR诊断方法。另一个温度循环法是由卢克·李,加州大学伯克利分校生物工程教授。他设计了一种循环温度更快-使用等离子光与金属表面电子的相互作用产生热量。led热120纳米金薄膜接触DNA的解决方案在一个微流体。机制允许骑自行车从55°C到95°C,在5分钟30倍。

O ' halloran QuantumDx推出了便携式桌上型设备,可以减少测试只需7分钟,并提高灵敏度的下1细胞每毫升-一个巨大的进步在每毫升150个细胞的标准方法。这是通过使用聪明的微流体和纳米线场效应晶体管技术。⁷我们解决一些敏感性问题通过使用一些非常新颖的物理称为双向电泳,”O ' halloran解释道。这种现象导致一个力作用在一个粒子在非均匀电场和允许精确的细胞从原始样本被捕获感兴趣的:“我们建立电场频率和幅度,导致偶极矩特别感兴趣的细胞中,我们使用微观流体集中细胞释放到我们的PCR。

在大型诊断实验室,大多数PCR是由自动化,机器人,高通量系统。但PCR的标准化和质量控制仍然需要人类输入费力。创新创业、诊断。我想出了一个解决方案,使用人工智能。我们有效地为学习机器监督数据集,一组输入数据与一些已知的结果和学习机器本身会自动检查并确保它可以给相同的结果经常——这不能没有手动输入当前系统的变化实时PCR在不同平台和化验,”Cohen说。一旦建立了他们的系统,结果几乎立即可以报告,它只会唤起大家意想不到的结果,需要进一步分析。系统是由英国最大的提供者进行病理服务,Viapath在他们的一个旗舰实验室。

数字精度

发明于1990年代早期,但在1996年被qPCR取代,数字为专家应用PCR已卷土重来。技术不需要标准校准但作品通过将最初的样本为大量的个别井之前放大,以便每个井将有1或0 DNA分子(数字)。放大后,积极或消极的井的简单的计算可以确定绝对量化。⁸

“数字允许的精度水平,你不能实现qPCR,”桑德斯说,但O ' halloran指出,大多数临床应用它实在是多余的。它是有用的,当你需要确切地知道有多少目标样本。例如有一些癌症是由多个相同的基因副本,所以拷贝数变异,了解副本的数量可以改变治疗方案,”桑德斯说。她说目前大多数医院没有这种仪器;“需要成本降下来,如果市场上有更多的平台。”

展望未来

PCR诊断也将产生重大影响精密医学的未来增长——定制个别病人的医疗保健。O ' halloran说QuantumDx已经开发出一种华法林测试。抗凝血药物的选择了几十年,它最近被换成了昂贵的替代品由于血栓形成的风险和其他并发症患者的一个子集。(抗凝血剂)的增加花费每年几十万英镑,”O ' halloran说,但是,“我们已经开发出一种测试,让我们做一个快速测试然后告诉病人的医生可以把华法林,(这是我们的人口的75%)。

最终O ' halloran认为PCR诊断方法,将扩展到初级保健:“你会看到它在医生办公室和药房,这将是一个非常激动人心的PCR的时候了。QuantumDx手持PCR设备上工作,他认为总有一天它会坐在我们家药柜旁边的温度计,“我看不出任何原因不能在10年内发生。

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