设计一个简单定量免疫印迹实验
尽管西方墨点法是一种行之有效的实验室技术,它最近受到了攻击作为量化方法,因为极端时必须小心生成和解释结果数据。
文章发表在最近的一个方法生物医学研究的国际和由Bio-Rad科学家提供了一个严格的和简洁的工作流与特定指令如何生产和使用免疫印迹实验分析定量数据。
我们采访了论文的合著者之一,肖恩·泰勒博士Bio-Rad现场应用科学家,了解更多关于再现性的问题和提出技术如何克服它们。
阿瑟:多大的问题是贫穷的再现性定量免疫印迹实验吗?
肖恩·泰勒(ST):现在有发表评论(1 - 4),博客文章(收缩观察和研究门),甚至一个组织(科研诚信办公室(ORI))致力于评估发表的质量数据来自西方的屁股。一些文件包含数据显然是操纵导致收缩但有很多文章已经发表和重载的蛋白质可能误导或错误的结论。这些科学家们不是故意发表artifactual数据只是设计他们的免疫印迹实验已经被那些教。这些方法已经从一代传给一代科学家来自早期的技术,当西方墨点法只是为了检测目标蛋白的存在与否的样本。相同的技术仍被许多实验室应用试图生产定量免疫印迹数据没有调整适当的程序和验证所需的步骤来获得可再生的和定量的结果。
阿瑟:这些问题局限于繁殖工作从期刊或这也适用于重复协议在同一个实验室?
圣:这些问题都适用于复制先前公布的数据和重复相同的实验在实验室之间,因为历史上应用免疫印迹技术从几十年前不定量。这就像问两个基本的烹饪技巧的人准备一个意粉酱从相同的成分,但没有配方,没有测量勺子的期望最终产品味道会是一样的。即使一个人尝试这个任务,这将是一个重大挑战,没有一些指导方针。这并不是说人们执行西方墨点法涉及很多猜测(尽管许多沮丧的科学家认为是这样),它仅仅是没有严格的方法发布或发表的研究人员试图生产定量数据的技术。这导致了广泛的不同数量的方法来设计免疫印迹实验和分析相关数据,而不是使用一个公认的标准,已被科学界审查和接受。
阿瑟:你相信是再现性差的主要因素?
圣:从实验设计的角度来看,这两个主要因素,免疫印迹数据再现性差:1)没有标准曲线生成测量感兴趣的蛋白质。没有这个引用,不可能保证检测的线性动态范围的定量测定和2)过程很长,有很多步骤,应用各种强调个体间和实验室之间的技术甚至在给定实验室难以或不可能复制数据生成之间的实验。
与RT-qPCR一样,西方墨点法的主要覆盖再现性差的原因是我们所发明的一个词“历史biase”,科学家今天执行定量免疫印迹从那些在他们面前。这种世代传递信息的方法通常是一个很好的学习方式的基本技术,形成一个强有力的基础知识,我们可以构建做研究。然而,当这些基本技术从过去被认为是黄金标准,然后应用到最近的或先进的设备、试剂和数据分析方法没有理解适用性和潜在影响,它可能会导致意想不到的结果。关键使用适当的化学发光图像捕获技术是基于摄像头成像系统如ChemiDoc MP。电影绝对不推荐,我们将演示数据质量的差异之间的电影和基于成像检测在去年发表的一篇文章中,我们在同行评议的杂志分子生物技术[5]。
同时,许多研究人员随机负载每车道的一个固定数量的蛋白质免疫印迹凝胶,通常介于10 ug和80 ug的饱和量为典型的管家蛋白加载控制导致不当和非量化数据样本之间的关系正常化。它也可能导致靶蛋白的饱和的污点将认为没有变化的工件膜蛋白表达之间的样品饱和。这是我们最近发表的一篇文章中解释的详细程序使用免费的凝胶染色技术来避免这个问题。
阿瑟:你的技术如何帮助克服这些常见的陷阱?
圣:总结本文的技术细节逐步执行许多步骤方法定量免疫印迹实验通过数据分析样品制备在一个严格的过程。从本质上讲,我们写了一个配方帮助保证产生的免疫印迹印迹和之间的数据将可再生的和定量的实验。RT-qPCR, MIQE指南[6]和[7]后续文章发表,以帮助科学家产生可靠的和可再生的数据从这个技术,已经被引用超过2000次。等定量免疫印迹没有发布的官方指南我们有本文试图纠正这一问题。
阿瑟:你相信有研究人员按照该步骤一步一个标准化的免疫印迹工作流吗?
圣:这当然是写这篇文章的目标结合我们之前的论文[5]提供定量免疫印迹的指南。两篇文章在一起已经被下载超过二千次,定义的方法论论文(的视频http://youtu.be/q0T_Af7khHw)结合本文的(http://youtu.be/iCgmeufGM2g)已经被浏览超过三千次只有9个月。这当然是指示性的需要这类信息的全球科学家正在试图生产固体和可再生的数据从西方印迹。
肖恩·泰勒说阿什利,总编辑技术网络。188金宝搏备用你可以找到阿什利Google +并遵循技术网络188金宝搏备用推特。
1。Savla,美国2004年。当每个人都变得如此顽皮的吗?j .中国。投资,113:1072。
2。罗斯纳,m . 2006。如何防范欺诈形象。科学家。20:24。
3所示。罗斯纳,M。2004年,山田K.M.。图片里是什么?图像处理的诱惑。j .细胞生物166:11-15。
4所示。亚当·马库斯和伊万Oransky”,我们能相信西方的屁股吗?”,实验室,2 - 2012,41岁
5。泰勒SC, Berkelman T, Yadav G,哈蒙德先生定义的免疫印迹方法可靠的量化数据。生物科技摩尔》。2013年11月,55(3):217 - 26所示。
6。参赛SA et al . MIQE准则:最小信息出版定量实时PCR实验。中国化学。2009年4月;55(4):611 - 22所示。
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