探索液滴数字PCR技术

液滴数字PCR (ddPCR)技术是一种利用水-油乳液体系的数字形式的PCR方法。该技术将核酸样本分割成数千纳升大小的液滴。然后在每个液滴内进行PCR扩增。这种方法比现有的其他PCR方法需要更少的样本，这在许多情况下都是有利的。最近，我们采访了Bio-Rad实验室数字生物学组临床主任George Karlin-Neumann，以了解更多关于ddPCR及其应用的信息。

什么是液滴数字PCR ?它的主要临床应用是什么?

乔治·卡林-诺伊曼(GKN):数字PCR (dPCR)是一种检测和量化核酸目标序列的方法，通过将样本细分为许多小分区或隔间，每个隔间或包含或不包含感兴趣的目标。在对端点进行典型的Taqman反应后，计数阳性分区(即强烈荧光)。

液滴数字PCR (ddPCR)是dPCR的一种实现，它使用动态生成的液滴作为样本分区，而不是预先形成的纳米室。在ddPCR中，在液滴流式细胞仪中读取液滴，以记录样品中阳性和阴性液滴的数量，从而使科学家能够确定样品中存在的目标分子的浓度。ddPCR是一种可以检测和精确量化各种类型的DNA和RNA改变的技术，具有高度的可靠性，使用非常少或大量的样本(即只有少数或>万份的目标存在)。这种能力使它在使用血液样本的液体活检等应用中非常有用，并迅速被实验室采用。ddPCR常被癌症研究人员和肿瘤学家用于跟踪疾病进展和确定治疗反应。其中一项针对非小细胞肺癌患者的检测是使用血液样本检测DNA突变，并在72小时内，即在成像结果公布前几周或几个月内将结果反馈给肿瘤学家。

基于ddPCR技术的QXDx CR-ABL %IS试剂盒已通过ce - ivd标记并获得FDA批准。医生可以使用这些系统和测试来检测慢性髓系白血病患者的微小残留疾病，从而更确定地做出治疗决定。Bio-Rad的QX200 ddPCR系统在其他临床和非临床应用中也显示出了前景。临床应用包括监测肾、肝和肺移植的有效性，在无创产前检查中检测胎儿非整倍体和孟德尔病，病原体和新生儿遗传疾病，如脊髓性肌萎缩。在实验室研究中，ddPCR可用于检测和测量单核苷酸变异，索引，拷贝数变异，基因重排，基因组结构，甲基化DNA，基因转录本和mirna水平，特别是应用于癌症液体活检，传染病研究和临床测试。最后，ddPCR还可以用于环境检测，例如通过基因改造测量水质和食品污染。

MC:为什么在液体活检中ddPCR和NGS联合使用比单独使用更有优势?

GKN:ddPCR和NGS在基于液体活检的癌症诊断中起着两个关键但独特的作用。通过液体活检，临床医生可以从血液或其他体液(如尿液)中收集无细胞肿瘤DNA，并检测和量化已知突变，以开出靶向治疗方案，或根据肿瘤的遗传特征跟踪患者反应和疾病进展。NGS是鉴定最终会影响癌症进展的ctDNA新突变和重排的金标准技术。通过基因组或全基因组测序，NGS产生了肿瘤突变的广泛清单。但是使用NGS随着时间的推移来跟踪这些突变的成本过高。与ddPCR相比，它也需要大量的劳动，并且返回结果的周转时间要长得多，而ddPCR通常对已知的改变具有更高的精度、灵敏度和特异性。然而，结合ddPCR和NGS可以利用这两种技术的优势并克服它们的局限性。一旦NGS被用于检测ctDNA中的全套突变，研究人员就可以依靠ddPCR的敏感性和准确性来监测更小的可操作基因标记，并几乎实时跟踪肿瘤进展和治疗反应。液滴数字PCR与NGS相比在速度和价格上的优势使其在串行监测方面更具吸引力。ddPCR还可以报告每毫升血液中突变的绝对副本，这可能是一个比突变等位基因频率(MAF)更可靠的指标，当需要精确的定量测量来做出临床决策时。

MC:为什么ddPCR比NGS更具成本效益?

GKN:不同于NGS，它提供了基因组的自上而下的视图，ddPCR专注于精确和可重复的检测和定量的已知目标与表型的意义。ddPCR还需要在进行测试之前对样本进行最少的操作;它不需要像NGS那样构建库。此外，ddPCR是稳健的，可重复的，并容忍抑制物质，使失败的反应很少。良好的动态范围和灵敏度，以及每次ddPCR反应可定量2个以上靶点的多路复用，将使大多数生物测量只需运行一个或几个孔。

MC: ddPCR如何用于预测术后癌症复发?

GKN:使用ddPCR技术评估液体活检样本使医生能够在治疗期间很早就预测患者的反应。我们已经在许多癌症类型中看到，患者的循环肿瘤DNA (ctDNA)水平与他们的治疗结果相关。例如，在今年的美国癌症研究协会会议上，研究人员在一项原理证明研究中表明，ddPCR可以预测恶性胸膜间皮瘤(MLM)患者是否对手术有积极反应。科学家们比较了11名MPM患者的肿瘤组织和正常组织之间的遗传差异，并开发了一种ddPCR方法，可以检测MPM特异性ctDNA。当他们测试术前采集的患者血液样本时，他们发现携带mpm特异性ctDNA的患者术后预后较差。在今年美国临床肿瘤学家学会会议上发表的另一项研究中，研究人员使用ddPCR追踪儿童骨肉瘤患者ctDNA的基因重排和拷贝数变化。在对这些患者进行手术或化疗前后的跟踪后，他们发现重排标记物的存在预测了85%患者的治疗结果，并与复发的可能性相关。

MC:在临床环境中使用ddPCR有什么限制吗?

GKN:基于ddpcr的液体活检并不是对每个癌症患者都有效。ddPCR一次只能检测少量突变和少量基因靶点。在需要分析大量候选突变的癌症中，NGS将是一种更好的方法。最后，由于液体活检通常依赖ctDNA, ddPCR或NGS都不适合监测不释放DNA到血液中的肿瘤，比如脑瘤．对于这类癌症，成像等传统技术可能更有效。

MC: ddPCR技术如何继续改进?

GKN:ddPCR技术已经可以在短时间内可靠地监测患者对治疗的反应。Bio-Rad正在致力于提高ddPCR的能力，以实现更高水平的多路复用，其中有限的样本可用性和对多个目标的最大灵敏度是需要的。实现更强大的扫描方法ddPCR可以让我们筛选DNA片段，在基因组的特定区域的多个位置进行改变。

对于未来，Bio-Rad正在努力提高ddPCR的容量，以实现更高水平的多路复用，其中有限的样本可用，并且需要对多个目标的最大灵敏度。我们还在开发ddPCR与ngs分析样本更好结合的方法，以提高医生监测患者对治疗和疾病进展的反应的能力。

除此之外，还需要更多地了解我们自己的生物学。ddPCR不仅在癌症方面显示出了希望，而且在包括艾滋病毒、器官移植和I型糖尿病在内的其他疾病中也显示出了希望。随着我们对遗传学和表观遗传学在疾病中的作用了解的越来越多，研究人员将针对更多的情况开发新的基于ddPCR的检测方法，从而使ddPCR技术在实验室和临床中得到更广泛的应用。

George Karlin-Neumann, Bio-Rad实验室数字生物学组的临床主任，正在与技术网络的科学作家Molly Campbell交谈。188金宝搏备用