探索抗体-药物偶联物的潜力

抗体- - - - - -药物偶联物(adc)是一类相对较新的生物药物，通过连接剂将治疗药物附着在抗体上而产生。adc被设计为高度靶向的治疗方法，为疾病细胞提供具有非常高特异性的药物。

英国注册和自筹资金的慈善机构LifeArc拥有肿瘤学和非肿瘤学领域的多个ADC项目。188金宝搏备用最近有幸与LifeArc生物学科学家Laura Murch博士进行了交谈，以了解更多关于adc的知识。她强调了他们开发的一些用于识别候选adc的抗体特征分析，并谈到了adc的监管成功。

劳拉·兰斯顿(LL):adc的主要优点是什么?

劳拉·默奇(LM):抗体- - - - - -药物偶联物(adc)由3个部分组成:单克隆抗体、有效载荷(药物)和连接子。这种抗体和小分子药物的组合赋予adc一些单独单一疗法不具备的有益特性。首先，迄今为止许多adc中使用的有效载荷是剧毒的，因此不能单独作为单一药物在有效剂量下使用而没有严重的脱靶副作用。其次，该单克隆抗体赋予了特定抗原极高的特异性，从而为肿瘤细胞提供了有效载荷的靶向递送。此外，adc只有在到达目标时才会被“激活”，在那里有效载荷被释放。在此之前，细胞毒性载荷不能自由地破坏健康组织和细胞，这将最大限度地减少全身暴露，因此限制了负面副作用。由于这种靶向给药，低当量剂量的小分子疗效应该是可能的，从而改善治疗窗口。最后，adc具有较长的半衰期，在某些情况下可以允许每周给药，这对患者的生活质量有积极影响。从本质上讲，ADC结合了抗体的高特异性和长循环半衰期与高细胞毒小分子的效力，这使ADC与单一疗法相比具有更好的治疗指数。当然，也应该指出，到目前为止，这种模式还存在一些困难。 Off-target toxicity was an issue in some early formats of ADCs, where the payload was released before reaching its target, but recent developments in linker and conjugation technology are attempting to address this in novel ways. Additionally, developability of these complex molecules has proved challenging in the past as large-scale manufacturing of ADCs requires a combination of relatively high-cost facilities including high level containment (due to the toxic payload) and GMP level antibody manufacturing. This is improving due to a rise in CRO expertise dedicated to offering these services. As such, this is an exciting and rapidly evolving field with a growing knowledge base, built around designing highly specific and functional ADCs with the requisite facilities to produce these on a large scale.

DAR是什么?它对ADC的性能和功效有什么影响?

LM:平均药物-抗体比(DAR)是ADC的一个重要值。DAR描述了每个抗体附着的药物分子的数量，并根据所使用的偶联方法而变化。DAR值对ADC的性能有很大的影响在体外而且体内。项目团队通常需要平衡有效载荷的效力和ADC的DAR值。高平均DAR值通常(但不总是)导致ADC在测试期间的有效性在体外研究，但这种功效并不一定转化为在活的有机体内ADC的生物物理特性占主导地位。例如，具有强效毒素平均DAR高的ADC将倾向于诱导宿主清除机制。因此，由于存在大量有效载荷，高平均DAR ADC可能表现出更好的肿瘤杀伤潜力，但较高的清除率可能导致肝毒性。因此，DAR是开发ADC时需要仔细评估和考虑的关键属性。

应该注意的是，DAR是一个平均值，对于目前批准的许多ADC，所使用的共轭方法会生成高度异构的ADC产品。这在考虑ADC治疗的药代动力学和药效学(PK/PD)时具有影响，因为不同的DAR物种将具有不同的属性在活的有机体内．由于技术的进步，使用特定位点共轭生成的ADC变得越来越普遍，并能够生产出明显更均匀的ADC产品。这些更均匀的adc具有明显的优势，与高度异构的DAR adc相比，具有更均匀的PK/PD配置文件，可以更容易地建模和随后调整。在LifeArc，我们通常使用高分辨率质谱法确定adc的平均DAR。使用我们内部的Q-Exactive BioPharma平台，我们可以在变性或原生条件下完整地分析adc，以及在亚单位水平上分析adc。我们还可以应用肽图谱工作流程来识别抗体上的药物偶联位点，从而提供我们adc的完整特征。

今天李华学了两个常用语。

LM:ADC疗法的市场继续扩大，2019年有3个新的ADC获批。目前，FDA批准上市的adc共有7种(均用于肿瘤适应症)，目前有80多种adc正在临床开发中。大量的下一代adc目前正在临床开发中，这凸显了adc在肿瘤学和其他治疗领域日益增长的需求。第一代adc的初步成功和挑战产生了关于adc生物药理学的重要知识。这导致了新技术的发展，以提高特异性和降低毒性。下一代adc通常使用人源化或完全人源抗体，而不是小鼠抗体或嵌合抗体，大大降低了免疫原性的风险。如前所述，有效载荷的特定位置共轭现在是可能的，允许生产单一DAR物种adc，而不是DAR值的异构混合物。这些单雷达物种具有向目标提供一致数量的有效载荷和更简单的PK/PD配置文件的好处。连接剂的稳定性也得到了改善，这意味着在到达目标抗原之前释放的有效载荷更少，因此脱靶毒性更低。这些进步的结合为下一代adc带来了巨大的希望。 Indeed, if the potential improvements in efficacy and safety are realized during current clinical development and evaluation, the field is likely to continue to expand over the next 5–10 years with many more regulatory approvals including for non-oncology indications.

今天李华学了两个常用语:好的ADC目标是什么?

LM:adc理想的良好靶点是那些在肿瘤/靶细胞表面过表达，在正常组织中低表达或不表达的靶点，但重要的是要了解疾病背景下的每个靶点。对于细胞毒性adc，靶点应该表现出良好的内化特性，因为细胞内追踪到溶酶体和内体区室是许多连接体释放技术良好工作的关键。应该注意的是，如果复合物被循环到细胞表面，有效载荷被释放到肿瘤微环境中，那么周围的肿瘤细胞可能会产生旁观者效应。虽然这在实体肿瘤中可能是有益的，特别是如果肿瘤细胞的靶点表达水平不同，它需要在靶点的基础上仔细监测。收集证据也很重要，证明所选的毒素-连接剂组合可以有效地释放有效载荷，并在表达靶标的一系列相关细胞系中诱导细胞毒性，因为这可以建立特异性和有效性的信心。最后，通过考虑可以通过选择性重定向非特异性有效载荷来解决的生物学问题，承载非细胞毒性有效载荷的ADC正在帮助重新定义什么是好的ADC靶标。

今天李华学了两个常话:LifeArc在肿瘤学和非肿瘤学领域有哪些ADC项目?

LM:LifeArc参与了我们三个主要治疗领域(肿瘤学、神经科学和抗感染)的众多项目，其中包括ADC项目以及许多其他模式。ADC项目是LifeArc的天然选择，因为我们的化学、生物和生物治疗团队都位于同一栋大楼，这意味着这些项目团队可以跨学科，并立即从不同的专业知识中获益。我们已经研究了两个细胞毒性ADC项目，并正在寻求扩展到涉及非细胞毒性有效载荷的项目，在这些项目中产生的ADC将具有不同的作用模式。例如，最近内部开展了一个早期研究项目，该项目基于一种针对MMP-9的非内化小分子负载ADC。¹这当然是我们正在继续开发和扩展的东西。

今天李华学了两个常用语，一个是抗体鉴定，一个是adc。

LM:由于选择合适的具有良好性能的抗体对adc的开发非常重要，因此LifeArc开发了抗体表征分析工作流程。

绑定:抗体克隆最初测试与感兴趣的靶标结合，以及与背景细胞系的非特异性结合，以突出阳性克隆。对于本实验，我们使用Intellicyt®iQue Screener上的流式细胞术，因为这是一种相对快速的方法，可以同时分析多个克隆的特异性。

国际化:抗体显示出特定的结合目标，随后测试其内化能力。我们为该分析设置了两种检测格式，一种是高通量检测，以测试大量克隆作为分类，另一种是低通量，提供更深入的分析和跟踪抗体内化到溶酶体。这两种分析都是基于图像的分析，使用IncuCyte®S3和IN Cell Analyzer 6500进行设置海关分别。

对于使用IncuCyte®S3的高通量测定，抗体克隆用ph敏感染料标记，该染料仅在酸性条件下(即在溶酶体的低ph值中)荧光。用ph染料标记的抗体克隆处理表达感兴趣目标的细胞，并在IncyCyte®S3上监测24小时内的荧光。内化的抗体随着时间的推移荧光会增加。

表现最好的抗体克隆然后在第二次试验中进行测试，在那里它们直接与荧光染料结合。靶细胞用核标记物和荧光溶酶体标记物标记，随后用标记的试验抗体处理。使用IN细胞分析仪6500在几个时间点监测内化海关(图1)。内化的量可以通过监测荧光标记的抗体来量化，我们也可以观察抗体与溶酶体标记物的共定位量，以了解抗体内化时是否跟踪到溶酶体。那些有可能用于ADC格式的候选基因通常需要内化到溶酶体以释放有效载荷。

图1:抗体内化。过表达感兴趣靶点的HEK293细胞用Alexa488标记的测试抗体或同型对照抗体孵育，并在IN Cell Analyzer 6500HS上监测0和48小时内化情况。细胞的细胞核(Hoechst，蓝色所示)和溶酶体(Lysotracker™深红色，红色所示)染色。测试抗体染色在0小时主要是膜限制，而48小时时可以观察到点状绿色和黄色染色，显示抗体内化。黄色染色表示红色溶酶体染料与Alexa488标记的测试抗体共定位，表明对溶酶体的跟踪。

细胞毒性:抗体也测试他们诱导细胞杀伤的能力，利用第二抗体Fab片段，这是共轭到有毒有效载荷，以模拟ADC。抗体克隆与二次偶联Fab-Tox孵育，然后在剂量反应实验中对表达我们感兴趣的目标细胞进行测试。使用IncuCyte®S3在48-72小时内监测细胞活力，使用Promega celltitrel - glo®在72小时内获取终点活力读数。通过这种方式，我们可以深入了解不同的抗体克隆在诱导靶细胞死亡的能力方面是如何比较的。

由于我们内部的抗体专业知识，我们经常通过一套行业标准的生物物理分析来运行有前途的抗体候选。所有特征分析的数据被整理和分析，以确定哪些抗体克隆应该进一步进行ADC开发。

劳拉·默奇博士与劳拉·伊丽莎白·兰斯顿进行了交谈，她是技术网络的高级科学作家。188金宝搏备用

参考文献
1.爱，等(2019)开发一种抗体-药物偶联方法来选择性抑制细胞外蛋白．Chembiochem。DOI: 10.1002 / cbic.201800623