液和微泡:表征纳米粒子的跟踪分析

纳米粒子跟踪分析(NTA)概述

NTA利用光散射和布朗运动的性质,以获得样品的粒度分布在液体悬浮。一束激光通过样品室,和粒子悬浮在这个波束散射光线的路径以这样一种方式,他们可以很容易地通过20 x放大可视化显微镜上安装一个摄像头。相机,以大约每秒30帧(fps),捕获粒子移动的视频文件在布朗运动的视场内大约100μm x 80μm x 10μm(图1)。

图1:光学配置用于NTA的示意图。

粒子的运动捕获在一帧一帧的基础上。专有NTA软件同时识别和跟踪每个观察粒子的中心,并确定每个粒子的平均距离感动在x和y的飞机。这个值允许粒子扩散系数(Dt)来确定的,如果样品温度和溶剂粘度η,sphere-equivalent水动力直径,d,粒子可以确定使用Stokes-Einstein方程(方程1)。

K_B是玻尔兹曼常数。

NTA不是一个整体技术询问大量的粒子,而是每个粒子大小的分别,不考虑别人。NTA所产生的大小分布配置文件的一个示例如图2所示。

图2:NTA所产生的大小分布配置文件的一个示例。模态的大小对于此示例是发现约70海里,与较大的颗粒大小也在场。

此外,测量粒子的运动在一个固定的视野(大约100到80年μmμm)被一束大约10μm深度。这些数字让样品的散射体积估计;通过测量粒子的浓度在这个视野和推断更大的体积可以达到每毫升浓度估计的粒子对于任何给定的类或整体总大小。

外来体和微泡特性

而原则支撑纳米粒子跟踪分析(NTA)技术描述了在前面的白皮书,它必须重申,使用高强度激光结合低背景光配置允许深亚微米尺寸的颗粒是可视化的,较低的粒子大小的范围取决于粒子折射率可以衡量的。而对高折射率粒子,如胶体金、准确测定大小可以降到15 nm直径,实现对低折射率粒子,如液等生物性,最小可检测可能只有30 - 40 nm大小。然而,这个最小尺寸限制允许的分析微泡的大小和液通常远低于300纳米的检测阈值对大多数商用流血细胞计数器。上大小限制时靠近粒子的布朗运动变得太局限于跟踪准确,通常1 - 2μm直径。

纳米粒子的激光照射可以兑换一个具有荧光可以兴奋,使纳米粒子进行荧光示踪分子可视化,跟踪从而大小和浓度测量具体通过使用适当的光学过滤器。因此,而不是通常的638 nm红色激光,532海里的绿色激光二极管可以用来激发一系列有机荧光团,而深蓝色/紫405 nm激光二极管允许半导体CdSe纳米晶体(也称为量子点)被发现在一个个人的基础上。488 nm激光二极管同样可以用来激发更多的传统染料在流式细胞术历史上使用。

通过使用特定的抗体介入荧光团标签的液,群体表型出现在复杂混合物因此可以实现。特定的重要性在这方面是能够形成物种特定外来体类型的抗体(Ab)标签,同时测量大小的外来体通过分析它的布朗运动,两个相互独立的测量。还请注意,这种标记液的浓度仍然可以恢复和类似大小的总数相比结构是否贴上标签。

氮川三乙酸比较流式细胞仪和电子显微镜

NTA是绝对的技术中,纳米颗粒的大小是通过测量的动态的布朗运动行为,独立分散的光线的粒子(作为独立的粒子质量或密度)。当然,这是不正确的流式细胞术的大小估计纯粹基于粒子的光散射强度(通常是在低角),因此要求,准确的测量,pre-calibration非常相似的折射率粒子的纳米颗粒样品或样本纳米颗粒本身的需要大量的先验知识的光散射特性。因此,虽然诺尔特- t Hoen et al。(2011)荧光技术的发展定量和定性描述流仪分析纳米级细胞衍生膜囊泡,NTA被用来校准系统calcein-labelled脂质体制剂和CFSE-labelled鼠肝炎病毒粒子系统功能演示。然而,广角流仪向前散射可以用于更大、更高的折射率100 nm和200 nm)荧光标记的校准珠子。这组然后扩大研究CD4 + T细胞激活促进微分释放不同的纳米囊泡的数量(van der Vlist et al . 2012年)。

流血细胞计数器校准的有效性的问题与聚苯乙烯珠当应用程序的研究解决了微粒子和液范德堡尔et al。(2012)。认识到聚苯乙烯珠有不同的光学特性生物囊泡,因为造成检测信号的机制还不完全清楚,预期之间存在矛盾和观察到的结果。为了克服这些限制,这组试图用米氏光散射的理论模型。然而,他们发现,不论应用控制,多个囊泡小于220纳米或多个89纳米硅珠被算作一个事件信号在足够高的浓度。他们得出的结论是,泡由流式细胞术检测是由于大单囊泡和群检测更小的囊泡,即同时被多个囊泡激光束,算作一个事件信号。群检测允许集体检测比之前认为的小泡,解释了发现流式细胞术低估了囊泡的浓度。这一发现是由哈里森和加德纳的言论(2012)。

乔治- et al。(2012)分析了滑液(SF)派生MVs,等离子体和科幻的样本骨关节炎(OA)患者,类风湿性关节炎(RA)和青少年特发性关节炎,使用电子显微镜和NTA确定科幻样品的粒度分布以及使用流式细胞仪微分洗涤剂溶解的方法。他们显示在不同的技术整合结果的大小分布MVs科幻样本(80 - 400海里),NTA分析和质谱(MS)显示大部分事件相关的蛋白质总量,而不是细胞衍生囊泡。

更具体地说,乔治- et al . (2012 b),而一种改进流仪(FC)方法来揭示不同的微泡(细胞衍生微粒)签名在关节疾病。在承认MVs的分析体液尚未完全标准化,而且有许多缺陷阻碍这些结构的正确评估,他们表明,他们和其他NTA显示大量的粒子比MVs在场滑液(SF)骨关节炎(OA)患者的样本,类风湿性关节炎(RA)和青少年特发性关节炎(JIA)。有趣的是,总粒子浓度,以NTA,高出两个数量级的总数量被FC。这支持的“冰山”理论假设FC仅检测颗粒高于200 - 300 nm(尽管检测阈值也依赖于粒子的折射率)和大部分的粒子在SFs低于这个范围。另一方面,NTA检测任何粒子,而通过FC他们只列举真实(AX-positive,特里同敏感)vesicle-related事件。他们指出,使用荧光NTA系统的能力和特定的标签,个体数量也可能进行了分析。

Dragovic et al。(2011 b)首次尝试开发一个综合方法涉及流式细胞仪和荧光NTA描述细胞微泡和nanovesicles。后早期作品使用人类胎盘泡准备结合荧光团贴上anti-placental碱性磷酸酶抗体(NDOG2-Qdot605)、流式细胞术显示93.5%的囊泡标记阳性NDOG2超过90%低于1000纳米囊泡的直径之间的主要人口300 - 400 nm直径(Dragovic et al . 2011年)。然而,当相同的样本被荧光NTA研究,结果显示的大小分布NDOG2-labelled囊泡从50 - 600纳米,山峰在100 nm和180 nm。分析超离心机丸总细胞囊泡的免费血小板血浆(n = 10)透露,~ 200倍多泡检测使用NTA(平均泡大小251±35海里)与流式细胞术。他们得出的结论是,这些结果说明NTA更敏感比传统流式细胞术和极大地扩展他们的能力为分析微泡和nanovesicles (Dragovic et al . 2011 b)。

尽管流式细胞术被广泛认为是无法定期测量外来体准备,罗伯特et al。(2012)报道,一个高灵敏度流式细胞术提供标准化的测量使用的小型微粒子和流式细胞术研究微粒子和液最近被Baj-Krzyworzeka全面回顾了et al。(2012)。

电流检测和分析方法

的一个主要问题的隔离和净化液等复杂矩阵的体液是技术的缺乏,可以评估分数exosomal内容和浓度测量。

范德堡尔et al。(2010)指出,尽管越来越多的科学和临床利益,没有标准程序可用于隔离,检测和表征微粒子和液,因为它们的大小低于传统的流式细胞仪等检测方法。他们比较各种现有的理论性能和潜在应用光学方法,为了确定大小、浓度、形态、生化成分,和细胞微粒子和液的起源。他得出结论,几种(组合)方法可以检测临床相关的微粒子和液的性质,然而,由于生物体液的复杂性,隔离微泡已经被证明是极其困难的。因此,恢复和污染不能可靠地量化和隔离协议尚未标准化。全面比较不同技术他认为光散射技术的动态光散射(DLS)和NTA潜在能力测量的相对和绝对规模分布的微泡几分钟。拉曼光谱时,另一方面,有可能检测出大小、浓度、和生化成分单一微泡没有标签,小时的测量时间的顺序。从光学方法基于荧光,荧光NTA (fNTA)和荧光相关光谱(FCS)是潜在能力测量的绝对大小分布和获取生化信息通过应用荧光抗体标记,但认识到,这是不容易执行,涉及几个实用和光学问题。fNTA被认为是最合适的方法来检测大小、浓度、生化成分,和细胞的起源在高速微泡,尤其是微泡的方法可以确定相关特征直接在体液。

穆勒(2012)最近讨论小说研究工具的出现细胞特定类型液和微泡(emv)援引无数大小合适的技术分析,密度和分子组成emv一起分离纯化方法的改进的异构泡数量。此外,他认为最近的革命在质谱分析,(微)流式细胞仪,原子力显微镜、纳米粒子跟踪,若将大大促进所有组分的定量和定性分析在emv组装。技术将优先提供签名特定EMV子集,而不是一个或几个参数(s) EMV总人口的平均。因此,“相关的许多问题和缺点目前单个参数技术可以克服最近推出了氮川三乙酸方法使直接和实时可视化以及定量评价纳米粒子在射流样本(NPs)”。

氮川三乙酸类似的评估,郑et al。(2012)监控使用NTA Rab27外来体通路相关,表明它可以用来监控外来体分泌的抑制乳腺癌mda - mb - 231细胞表达抑制RNA针对Rab27a,外来体通路的一个已知的组成部分。他们得出的结论是,数据显示,“纳米粒子跟踪分析可以有效地使用和快速监控外来体分泌的破坏”。

新的商业测试

这就是兴趣的速度是建立在这一领域,众多新试剂和新技术的隔离,净化,有时,分析液或其内容最近开发和商业化;其中一些概述:

• Exomir™使用另一种方法通过注射器过滤器捕获样品液和更大的膜结合粒子,然后刷新与RNA提取试剂溶解qPCR捕获的粒子进行后续分析。
• Exotest™是一个专有的夹心酶联免疫试剂盒来捕获和量化液在等离子体基于管家蛋白的表达(CD63和Rab-5b)和肿瘤相关标志物,caveolin-1 (Logozzi 2009)检测液的等离子体的黑色素瘤患者作为一个潜在的癌症筛查和随访的工具。
• 基于研究Balaj et al .(2011),外来体诊断inc .)正在开发一个数量的分子诊断使用库的绑定试剂特定肿瘤特异性生物标志物来隔离液从更传统的三明治的后续分析癌症患者免疫测定技术。
• 利用技术开发的Delcayre et al . (2005), Anosys inc .)使用一个新颖的方法,称为外来体显示使外来体成分和裁剪的操作液与新理想的属性。
• ExoQuick™是一种聚合物专有的外来体沉淀试剂促进一步微rna和蛋白质生物标记提取液在等离子体和其他体液供qPCR后续分析。有趣的是,NTA是用来证实液的沉淀这种技术(Systembio技术手册》2011)。
• blood-based诊断技术,称为Carisome™,捕捉和描述循环微泡,包括液,也正在由Caris生命科学和基于工作最初由斯库格et al。(2008)。
• 外来体科学(2011),公司已经开发出一种96孔试验,允许研究人员在血液和其他体液隔离液使用酶联凝集素具体测定液(ELLSA),这是特定的,分析其可能通过检测分子(如抗体在外来体与一个特定的生物标志物。
• 生命技术公司最近所描述的新试剂的隔离液从复杂的媒体和生物流体与RNA标志识别系统用于离子激流(Magdeleno, 2012)。这试剂最近被提升为一个“完整的外来体工作流解决方案:从孤立到识别使用离子激流个人基因组的RNA标记机”由Vlassov(2012),使用NTA证明他们的试剂超速离心法一样有效的隔离液。同样,Zeringer(2012)描述了使用这种试剂液的浓度为下游不同样品类型分析。
• 最近,一个PureExo®外来体隔离设备(2013)已经由101生物公司号称完整液隔离效率95% <从血清或血浆中不需要ultra-centrifugation 2小时。
• 另一个工具包,Exo-spin™,适合制备纯广告,从各种生物功能液液体包括血浆/血清、细胞培养基、尿液和唾液。还自称是速度比超速离心法和比竞争对手更有效的工具(Exo-Spin, 2013)。再一次,他们用NTA确认他们的产品的质量。
• 一起的尿液外来体RNA隔离设备也广告构成一个一体化的系统来集中和隔离exosomal RNA从尿液和组织培养媒体。分离和净化尿液是基于旋转使用一起的专用树脂柱层析法分离矩阵,以下的液囊细胞溶解释放RNA,然后绑定到一起的树脂(绑定)进行后续分析
• 最后,HansaBioMed(2013)提供了外来体研究包括immunobeads产品。他们还卖NTA-analyzed液标准声称他们的“净化冻干液得到来自不同生物来源,包括从细胞培养上清液液、人血浆和尿液样本…”,“....隔离是通过超速离心法和微滤过程……液随后量化和验证整体蛋白质含量和粒子通过与NanoSight NTA数量。冻干法对exosomal蛋白质稳定性的影响等都与其他存储方法存储新鲜液在-20°C和确认其稳定性在12个月内4ºC”。

所有这些产品都是外来体隔离的替代品,但可能会出现缺乏特异性,因为沉淀步骤可能沉淀液中杂质。

应该进一步认识,此外,所有上述测试关注exosomal结构的隔离从复杂的生物体液(如血液、尿液等),以备后续分析通过更传统的机制(ELISA、qPCR等)。因此,他们可以被认为是散装净化/分离协议没有提供任何机会单独描述,表型和列举液本身。如下所示,这种能力将提供显著的优势在液开发诊断和氮川三乙酸是所提供的技术。

出现氮川三乙酸和评估为MV描述方法

在早期作品DLS测量微粒的应用(哈里森2008;哈里森et al . 2009),嘉丁纳et al .(2009和2010)开始使用NTA可视化,大小和浓度测量细胞微粒子和液。其他研究小组开始评估NTA pre-analytical的讨论和分析问题的分析血液中微粒(Yuana et al .(2011))和微粒的大小和浓度测量使用光散射方法(Gabriel和佐丹奴,2010)。

随后,Dragovic et al。(2011)扩展他们的工作分级和表型出现使用NTA细胞囊泡,而Sokolova et al。(2011)描述了液的特性来源于人类细胞NTA和SEM。进一步研究氮川三乙酸后专门使用的分析和浓度测量(循环)微粒(加德纳,2011);分析细胞外来体和nanovesicle分泌(战胜挑战者博伊斯et al . 2011);体内的分析推导出人类细胞外囊泡(泰勒,2011)和微泡的监测和外来体免疫细胞分泌物(秀et al . (2012))。克Gercel-Taylor et al。(2012)后来NTA用于循环细胞来源的分析卵巢癌患者的囊泡。

在研究其他方法,NTA也比较的量化和分析液在人血浆蛋白微阵列(Jørgensen et al。(2012))和隔离,浓度测量和表征液从正常的尿液(Dimuccio et al . (2012))。

Vlassov和他的同事回顾了液的主题,目前概况知识的组成、生理功能,诊断和治疗潜力突出以下几点:我)液微泡含有核酸和蛋白质,由所有细胞分泌;ii)液中发现大量的体液,包括血液、唾液、尿液;和iii)液最有趣的角色是细胞间的沟通。他们还描述液成分、函数和通路并讨论液用于潜在的诊断和治疗应用(Vlassov et al . 2012 b)。氮川三乙酸他们给几个例子分析液的液体样品,显示逐渐轻组分通过蔗糖梯度如图所示定义大小的粒子在这些制剂,从而证明如何轻松地NTA可以用来迅速提供大小和浓度信息相比,这种结构更传统的EM和DLS的行业标准方法。

NTA快速鉴定细胞来源的细胞外囊泡,低温电子显微镜和拉曼镊子显微镜被Tatischeff报道(2012)而Arigi et al。(2012)使用NTA在她的蛋白质组学分析和表征人类子宫内膜癌的细胞衍生细胞外微泡。黄et al。(2012)所描述的隔离液相关的肿瘤临床样品用超滤的方法。

NTA越来越被经常用于分析微粒子和液进行了广泛的研究。以下突出的一些研究,NTA证明核心识别microvesicular结构下的理化性质研究。

Cantaluppi et al。(2013)报道NTA数据(以及流式细胞仪、免疫印迹、生物分析仪和rt - pcr)在他们提交的论文中隔离,表征和pro-angiogenic活动的微泡(MVs)源自人类胰岛细胞而Katsuda et al。(2013)表明,人类脂肪tissue-derived间充质干细胞分泌功能neprilysin-bound液的研究积累β-amyloid肽(Aβ)在大脑受到阿尔茨海默病(AD)的影响。的前提Neprilysin (NEP)是最重要的Aβ-degrading酶,他们探索virus-mediated NEP基因传递使用NTA和TEM确认纯化ADSC # 4-derived液囊的大小在175海里。蛋白质含量和粒子数量的收获液是由布拉德福德法和NTA,分别。

朝圣et al。(2013)报道了非传统的某些细胞的分泌物co-chaperone stress-inducible蛋白1 (STI1)通过异质细胞外囊泡的人口。STI1缺乏一个信号肽和药理方法指出,它不遵循古典分泌机制。使用NTA专门测量浓度的电动汽车数量在他们的研究中,他们发现,星形胶质细胞分泌一种多样化的人口EVs来源于包含STI1多功能车辆总线和表明EVs和神经元表面组件之间的交互提高STI1-PrPC信号。

此前表明macrophage-derived基质小泡(MVs)与微钙化物质的形成动脉粥样硬化斑块纤维帽内,Hutcheson et al。(2013)发现了一个角色在脆弱的斑块形成微钙化物质管制macrophage-derived矩阵从脂质筏域囊泡的释放。NTA被用来描述释放的MVs RAW264.7巨噬细胞细胞系,与促炎细胞因子治疗后TNF-a (@ 20 ng / mL)。脂质筏领域被确定通过共焦显微镜使用霍乱toxin-based染色的GM1神经节甘脂。使用NTA动力学研究表明,未经处理的原始细胞释放MVs以恒定速率(平均R2 = 0.95) 24 h。治疗RAW264.7细胞TNF-a导致MV分泌率增加1.8倍后6 h。初始速率增加,进一步MV释放完全抑制24 h。

NTA也用于确定胎牛血清的贡献exosomal RNA在体外实验中(Shelke et al。(2013))和协助研究microRNA的内容从大鼠的尿液细胞外囊泡区分健康与多囊肾病(Moggio et al . (2013))。安东et al。(2013)表明,吸烟诱发和增加中性粒细胞和单核细胞微泡在敏感话题。

在寻找小说来源非侵入性疾病生物标志物和显示细胞外囊泡也发布了肝细胞RNA,之et al。(2013)最近表明,这些囊泡,可能参与星状细胞的活化,可能成为新源非侵入性的肝脏毒性标记的识别。NTA被用来描述在两non-tumoral肝细胞外囊泡释放模型:鼠肝细胞的主要文化和从一只老鼠胎儿肝脏祖细胞线。

Raposo和Stoorvogel(2013)最近生产的一个很好的全面审查的细胞外囊泡,液,微泡和相关结构,特别关注电动车的特征和目前提出了它们的形成机制,目标,和功能认识到缺乏知识的EV形成的分子机制和缺乏方法干扰包装的货物或与囊泡释放,然而,仍然阻碍他们的体内生理相关性的识别。

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