基因组DNA基因表达的表观遗传调控在细胞分化和生物发育中非常重要。表观遗传学也有助于人类疾病。在分子水平上，表观遗传学涉及组蛋白和组成染色质的DNA的修饰。已经鉴定出介导这些修饰的蛋白质家族，特异性结合相互作用的表征对于确定相互作用的特异性和亲和性非常重要。这一特性对于开发抑制这些染色质结合蛋白的药物也很重要。本白皮书总结了等温滴定量热法(ITC)如何用于表观遗传调控蛋白质的表征。
表观遗传学是研究由非遗传机制引起的基因表达的可遗传变化，而不改变基因结构或DNA序列。细胞的表观遗传状态在有机体的细胞分化和发育过程中不断进化，表观遗传变化与细胞重编程有关。由于表观遗传机制也可能在细胞水平上负责环境反应的整合，它们可能在某些疾病的发展中发挥重要作用。
图1。染色质和表观遗传机制的简化视图。转载须授权[55]
基因活性的表观遗传调控是复杂的，尚未完全理解，涉及转录因子，生长因子，可能还有激素。表观遗传过程也涉及染色质的修饰(图1)。组蛋白八聚体由组蛋白H2A、H2B、H3和H4的两个拷贝组成，被一条145-147 bp的DNA链包裹，形成核小体核心。多个核小体堆积在一起形成染色质。
表观遗传事件可能涉及组蛋白、DNA和RNA的共价修饰，以及染色质重塑、微RNA介导和染色质结构的其他变化。组蛋白的柔性n端尾部包含一系列称为“标记”的位点特异性翻译后修饰(PTMs)，包括赖氨酸的甲基化和乙酰化，精氨酸的甲基化，以及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化。组蛋白尾部的PTMs形成特定的模式，并被特定的酶以序列和修饰特异性的方式添加、读取和去除，从而产生额外的标记。组蛋白尾部标记的存在和不存在为下游效应蛋白的特异性结合和/或释放提供了独特的对接位点，从而发挥多种生物学功能，包括转录调控、细胞周期控制、分化和凋亡。
除了组蛋白尾修饰外，胞嘧啶碱基5位点的DNA甲基化构成了另一个常见的共价表观遗传标记，可导致基因沉默。
已经鉴定出介导这些修饰事件的蛋白质家族。化学修饰由“作者”进行，包括组蛋白乙酰转移酶，组蛋白甲基转移酶，组蛋白激酶和DNA甲基转移酶。已经鉴定出超过80种不同的书写蛋白。标记作为“阅读器”的对接模块，包括识别组蛋白上特定甲基化或乙酰化赖氨酸标记的蛋白质。已经鉴定出超过300种不同的阅读蛋白。这些标记是通过包括组蛋白去乙酰酶和组蛋白去甲基酶在内的“橡皮擦”去除的，目前已经确定了大约50种橡皮擦。
每个模块直接写入、读取或擦除标记的分子基础在单个蛋白质域内。这些结构域属于基于序列或结构域相似性而具有多个成员的蛋白质家族，它们通常作为较大的多结构域蛋白质和多蛋白质复合体的一部分存在。对于每个可能的标记，都有相应的写入蛋白、擦除蛋白和读取蛋白家族。
早期的表观遗传学研究专注于单一区域-单一标记关系，后来转向研究多区域-多标记相互作用，以及所谓的“表观遗传网络”之间的复杂关系和信号传递。这意味着有数百种参与表观遗传调控的蛋白质是药物发现的潜在靶点。
表观遗传机制的调节与许多疾病有关，包括癌症、代谢紊乱、炎症、中枢神经系统疾病和病毒感染。催化组蛋白PTMs的酶，包括组蛋白甲基转移酶、组蛋白去甲基酶、组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰酶，被认为是药物靶点。结合阅读蛋白的药物(如bromodomain)也在研究中。
有关表观遗传学和涉及表观遗传蛋白的药物发现的更多信息，请参阅最近的评论(2、3、7、11、13日,48岁,50岁,55岁,59岁,62年)．
由于染色质结合和修饰活性经常在多蛋白复合物中发现，因此描述单个染色质结合域是一个挑战．染色质结合蛋白通常使用对其功能至关重要的微妙亲和差异来区分组蛋白PTMs和序列上下文，而这些在基于细胞的分析中很难区分。为了了解染色质结合蛋白的功能、活性和特异性，每一种相互作用都需要通过一系列生化和生物物理分析来定义。
研究人员可以使用适当的酶测定方法来测量许多书写器和橡皮擦的活性。这些分析可以使用纯化的蛋白质或粗核提取物。由于阅读蛋白没有酶活性，研究人员需要通过其他生化和生物物理分析来测量结合相互作用。
染色质结合蛋白的特异性和结合亲和力的表征需要观察纯化的模块，具有所需的活性，与其组蛋白标记相互作用，如特定的溴域阅读蛋白识别并结合到组蛋白肽单乙酰化，二乙酰化或三乙酰化的特定位置。在体外生化检测包括ELISA、CHiP(染色质免疫沉淀)[52]，组蛋白肽珠基下拉分析[45]，凝胶位移分析。一些分析可以用核提取物完成，而另一些则需要纯化的蛋白质。
由于写入、读取和清除组蛋白甲基化的靶标已进入药物研发流程，支持筛选和化合物分析的高通量分析已变得更加复杂。合成组蛋白肽替代品(有适当标记)用于高通量组蛋白结合筛选试验，如AlphaScreen®[33, 76), AlphaLISA®[83]，以及SPOT分析(48, 51)．在药物-蛋白质筛选中常见的高通量试验是差示扫描荧光法(DSF)，其中药物结合是通过蛋白质热稳定性的变化来评估的。
这些生物化学和高通量筛选试验通过排序给出了关于特异性和相对结合亲和力的合理定性信息。重要的是要记住，组蛋白结合蛋白的定性生化分析在非特异性结合、伪影、可靠性和可重复性以及潜在的假阳性/假阴性结果方面存在许多潜在的缺陷。例如，AlphaScreen®检测有日常变化的问题[32]．
个体染色质结合相互作用的结合亲和力是通过精确测量其解离常数K来明确定义的D．K越小D，粘结亲和力越紧密。K的比较D值是一个重要的组成部分的结合鉴定，结合选择性评估，和特异性的相关蛋白家族(如bromodomains)结合到不同的组蛋白标记。KD数值在潜在抑制剂的设计和优化中也很有用。
上面所列的生化和筛选试验不能提供精确的钾D；许多亲和强度的排序基于读数(颜色变化，或凝胶带位置或密度)，或只是一个绑定/无绑定评估。AlphaScreen®测定给予IC50这些值与K相关，但并不相同D，而SPOT分析给出了基于斑点强度的相对亲和力。
重要的是，任何定性筛选都必须至少通过一种生物物理结合试验来测定钾D例如，表面等离子体共振(SPR)、荧光偏振、微尺度热泳(MST)或等温滴定量热法(ITC)。生物物理结合试验正交于主要结合筛选和提供定量KD测量。这些用于验证初始筛选数据，也检测假阳性、假阴性和原始分析固有的检出限。染色质界面的解离常数在纳摩尔(紧密结合)到微摩尔(弱结合)范围内，生化分析无法区分在这个范围的低端或高端的亲和力。生物物理分析通常需要纯化的蛋白质来获得定量结果。生物物理KD可以用野生型和突变蛋白以及不同修饰的组蛋白肽进行分析，以进一步表征其选择性和功能。
生物物理分析还提供了KD,如结合动力学、结合热力学和结合化学计量学。这些测量是通过正交试验提供的，并进一步深入了解相互作用的特异性和选择性、结合机制和活性结合域的结构。进一步的确认和表征来自x射线晶体学，核磁共振(NMR)和其他结构研究。
本白皮书讨论了ITC测定的特点，并解释了ITC如何用于测定KD涉及表观遗传蛋白和染色质的结合事件。本文介绍了几个案例研究，展示了ITC提供的结合亲和性和其他参数如何用于描述特定的相互作用，并设计抑制剂。
ITC测量与结合事件相关的热变化，确定任何生物分子相互作用的结合亲和力(或KD，解离常数)。现代ITC仪器测量的KD值范围从毫摩尔(弱亲和度)到个位数纳摩尔(紧密亲和度)。结合焓、熵和结合化学计量也可以用ITC来测量。ITC用于描述涉及蛋白质、核酸和脂质的结合相互作用。最近有一些关于国际贸易中心原则和应用的综述文章[81]．
ITC是生命科学中研究结合过程的“金标准”方法，因为它无标签、敏感、通用，并且可以与各种缓冲液中的不同材料一起使用。ITC是一种重要的生物物理分析方法，在同行评审的科学期刊中被引用了数千次。
图2展示了ITC的工作方式。将一个结合伙伴(“配体”)置于ITC注射注射器中，将其滴定到样品细胞中，并与第二个结合伙伴(“大分子”)混合。配体和大分子可以是蛋白质、核酸、小分子化合物、脂类、碳水化合物、金属或任何其他相互作用的物质。两个绑定伙伴都在相同的缓冲区中。匹配的参考细胞通常充满水。
ITC系统被编程以定时间隔向大分子溶液中注入特定体积的配体。注射注射器的底部也有一个桨叶，所以在整个实验过程中混合物一直在搅拌。
莫尔文仪器公司有几种ITC仪器，包括MicroCal PEAQ-ITC和MicroCal iTC200。这些是“功率补偿”itc，测量参考电池和样本电池之间的温差，并改变热功率补偿以使温差归零。功率补偿与粘结热直接相关。
图2的中心是一个ITC实验的原始输出的表示。在这个例子中，结合热是放热的;也就是说，热变化的负偏转表示配体与大分子结合时释放的热量。每个峰代表单次注入配体引起的热变化。第一个峰很大，因为大部分注入的配体都与大分子结合。随着大分子被配体饱和，随着进一步的注入，更少的配体将结合，因此产生更少的热量。在实验结束时，很少有配体被结合，产生的少量热量是由于稀释热。
当原始ITC数据上传到ITC数据分析软件时，集成基线自动生成，每个峰的面积计算并绘制为细胞中配体与大分子摩尔比的函数。如图2的右侧所示。黑点代表单独的峰值。弯曲的红线是最适合的绑定算法，从中我们确定相互作用的焓，化学计量(n值:与曲线的中点有关)和亲和力(与数据的浓度和s型有关)。
KD由式1与相互作用的吉布斯自由能(∆G)相关:
∆G = RTlnKD(方程1)
其中R为气体常数，T为反应温度(单位为K)。∆G为负值时，反应才会发生。结合亲合力越强，K值越小D，∆G变负。
∆G与结合焓(∆H)和结合熵(∆S)的关系由式2表示:
∆G =∆H - T∆S(公式2)
结合焓和熵的表征提供了深入了解结合机制，包括氢键的参与，疏水效应，以及结合过程中发生的构象变化。热力学和亲和性都被用来描述与结合相关的特异性和结构信息。
图2。ITC如何运作。左图:ITC细胞和注射注射器示意图。中心:有代表性的ITC滴定实验原始数据。右图:ITC实验中具有代表性的结合等温线，适合一组位点结合模型。
ITC是一种建立的表观遗传调控蛋白质的结合测定方法。在过去的20年里，等温滴定量热法被用于研究数百个表观遗传读者、作家和橡皮擦，其中大多数研究在2010年之后发表。
已经发表了一些早期的研究，描述了使用ITC来识别和描述染色质阅读器蛋白-组蛋白相互作用[38] 30日31日．
在最初的生化筛选试验后，ITC被用作主要结合试验和次要/验证试验有以下几个原因:
ITC准确测量KD从毫摩尔到纳摩尔值，表观遗传蛋白质结合的典型范围。
ITC测量与粘结有关的热变化，是一种通用的检测系统。这意味着可以使用天然蛋白质，不需要任何类型的标签、标记、标记或修饰。
ITC是一种真正的溶液内方法，不需要固定，消除了潜在的硬脂/取向问题，以及与珠子或其他材料的非特异性结合。
ITC不需要任何特定的试剂或抗体，并且只需要极少的化验开发。
ITC基本上可以在任何生物缓冲液中进行，包括那些含有常见添加剂的缓冲液，如盐、还原剂、洗涤剂、辅因子等。
ITC不需要任何荧光测量，因此在基于荧光的检测中不容易受到潜在伪影的影响。
ITC没有分子量限制，可以用于任何大小的分子，以评估蛋白质-小分子，蛋白质-蛋白质，蛋白质-核酸的相互作用，以及那些大的多蛋白质复合物。
ITC的结果数据丰富——除了KDITC测量结合热力学和化学计量学，在结构生物学、构效关系和药物发现中很有用。
设计和软件的改进导致了与早期itc相比更敏感和使用更少蛋白质的现代仪器，使该技术更易于使用和更具成本效益。此外，这是一种非破坏性的技术，可以在实验后恢复珍贵的蛋白质。ITC的仪器也可以以自动格式提供，以提高吞吐量。
有关ITC的使用和组蛋白结合蛋白特性的更多信息，请参阅Malecek & Ruthenberg (2012)[45]．
ITC测量蛋白质结构域和染色质的核酸成分之间的结合。最近的一篇文章研究了哺乳动物5-甲基胞嘧啶氧化酶Tet3，并鉴定了含有n端CXXC结构域的全长异构体(Tet3FL)。[35]．该CXXC结构域被鉴定为表观遗传阅读蛋白。作为初步的结合筛选，作者使用含有所有已知胞嘧啶C5修饰的寡核苷酸进行了凝胶迁移率移位测定:胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。为了准确量化Tet30s CXXC结构域与未修饰的DNA和cacc修饰的DNA的结合亲和性，作者使用MicroCal iTC200系统直接测量小鼠Tet3 CXXC结构域与以未修饰的CpG二核苷酸或5caCpG二核苷酸(CcaCG DNA)为中心的12 mer复文DNA双链的结合。ITC分析表明，mTet3-CXXC结构域与未修饰的CCG DNA结合D约1.88µM，但与CcaCG DNA结合具有更强的亲和力(KD0.56 μ M)。
在本研究中，ITC也被用于测量mTet3-CXXC结构域与12 mer CmCG、CfCG或ChmCG DNA双工的结合，这些双工将5caC替换为5mC、5fC或5hmC。结果表明，mTet3-CXXC结构域与CmCG和CfCG结合D分别为5.59和6.13 μ M，对ChmCG的结合更弱。当其中一条DNA链上的5caC被未修饰的C取代，产生半羧化DNA (semi - ccacg)时，他们观察到mTet3-CXXC的结合亲和力略有降低D1.57 μ M。用A、T或G替换5caC之前未修饰的C也导致结合亲和力降低。ITC的数据证实，Tet3 CXXC结构域是CcaCG序列中5caC DNA的特定读取器。
作者选择了几个与CcaCG相互作用的mTet3-CXXC残基用于诱变，并使用ITC测量它们对mTet3-CXXC对CCG和CcaCG DNA的结合亲和力的影响。第一个观察结果是H81向丙氨酸的突变消除了CXXC结构域与CCG和CcaCG DNA的结合(与先前的结构观察结果一致)。其次，K88A突变导致>与CcaCG DNA的结合减弱了27倍，但与CCG的结合仅减弱了3倍。这些观察结果进一步证实了残基K88通过与5caC直接相互作用，在mTet3-CXXC和CcaCG DNA的特异性识别中发挥关键作用。第三，mTet3-CXXC T80A和Q82A突变都导致对CcaCG DNA的结合亲和力小幅下降(较弱)，这与结构观察结果一致，这两个残基都有助于与CcaCG DNA结合。总之，突变研究和ITC测定为我们对mTet3-CXXC-CcaCG复合物的结构观察提供了强有力的支持。
ITC还用于SUVH5 SRA结构域对5-甲基胞嘧啶氧化衍生物的识别[61]．SET-和环相关结构域(SRA)读取基因组DNA上的表观遗传标记5-甲基胞嘧啶(5mC)。作者进行了ITC结合和结构研究，以研究SUVH5蛋白的SRA结构域(SUVH5 SRA)识别5mC和其他修饰的分子基础。使用MicroCal VP-ITC，他们证明了SRA结构域与羟甲基化CG (5hmCG) DNA双工结合的方式与甲基化CG (5mCG)相似。此外，SUVH5 SRA结构域对羧化CG (5caCG)和甲化CG (5fCG)的亲和力较弱。ITC表明SUVH5 SRA以与5mC相似的方式识别5hmC，但对5hmC氧化衍生物表现出较弱的亲和力。
有几篇期刊文章引用了ITC的使用来研究组蛋白乙酰转移酶与其底物的相互作用，如乙酰辅酶a或辅酶a[1]，或组蛋白甲基转移酶结合辅助因子s -腺苷蛋氨酸[79]．
2014年的一项研究[70]观察了表观遗传作者组蛋白H4K20甲基转移酶Suv4-20h2与其组蛋白H4肽底物和s -腺苷蛋氨酸(SAM)辅因子的复合物。晶体结构分析表明，Suv4-20h2的活性位点偏离了规范域构型，并表现出高度的底物和产物特异性。通过甲基转移酶和生化结合实验，作者发现Suv4-20家族的酶采用单甲基化的H4K20底物，并产生了唯一的二甲基化产物。作者使用MicroCal iTC200观察了Suv4-20h平行序列和一个Suv4-20h突变体与SAM结合，并观察到相似的KD值(11至17 μ M)。引用作者的话:“考虑到结合常数的狭窄范围，SAM结合不太可能代表平行对数之间的生理显著差异。”ITC数据确实显示了结合焓和熵的差异，作者没有进一步探讨。热力学可以为Suv4-20h与SAM的绑定机制提供额外的见解。
大多数表观遗传蛋白结构域的相互作用涉及到与特定组蛋白的结合，因此合成组蛋白经常被纳入ITC实验，以及其他结合测定。ITC已被用于研究组蛋白甲基转移酶和DNA甲基转移酶与组蛋白的结合(12日,14日,15日,24日,43岁,79年,85年)．ITC也被用来测量KD与组蛋白结合的几种擦除剂，如组蛋白脱乙酰酶[10]，组蛋白赖氨酸去甲基酶[54]，朱蒙吉域[78] 27日28日和Sirtuin蛋白(80、84)．ITC测量KD在30纳摩尔到1毫摩尔范围内的相互作用。请注意，一些研究也观察了不同模块的相互作用，以及与组蛋白的相互作用。
许多研究人员使用ITC来表征读本蛋白与组蛋白肽的结合。包括14-3-3[77], chromodomain(34岁的30、63、71)博士手指(5、8,53岁,60岁)， PWWP域[74]都铎域[6, 22岁,49岁,58岁的73年,75年), WD40[46]，和叶芝域[41]．
bromodomain是一类主要的阅读蛋白，超过60种人类蛋白质至少包含一个bromodomain (BRD)模块。brd特异性识别组蛋白上的ε- n -赖氨酸乙酰化(Kac)基序。一些研究文章结合ITC数据来研究BRD相互作用(64年29日31日)．
结构基因组学联盟(SGC)的科学家最近对人类溴域家族进行了大规模的结构分析[18]．他们开发了一个重组brd平台，并将所有人类brd亚克隆到细菌表达系统中。在他们纯化了不同的BRD蛋白后，他们确定了BRD与SPOT肽阵列的相互作用位点，该阵列覆盖了人类组蛋白所有可能的赖氨酸乙酰化(Kac)位点。从SPOT中，他们鉴定出组蛋白肽上单个Kac位点的brd的485个相互作用。经ITC实验证实，KD值在3到730 μ M之间。他们还使用ITC表明，BRD肽的识别依赖于多个修饰的模式，而不是单一的乙酰化位点。值得注意的是，KD在溶液中通过ITC和SPOT测定(使用纤维素固定的组蛋白肽)并不总是相关的，这表明本研究中使用的与纤维素载体相连的肽不能通过SPOT定量结合亲和力。作者还指出，大多数BRD与组蛋白肽之间的ITC结合研究的结合化学计量量为1，这表明一个BRD模块结合一个组蛋白肽。然而对于bromodomain BRD4(1)，其化学计量值为0.5，表明其中两个BRD4(1)模块与一个二乙酰化组蛋白肽结合，一个BRD4(1)模块与一个单乙酰化组蛋白肽结合。
本白皮书中引用的大多数研究人员主要使用ITC来测量和验证KD，而其他人，如Filippakopoulos等人(2012)[18]，在他们的特征研究中也使用了化学计量学。ITC是唯一能够测量K的生物物理测定方法D，化学计量和结合焓。ITC也是唯一的生物物理化验直接为结合焓∆H。结合焓与氢键和其他非共价相互作用有关。当比较两个结合实验的结果时，如果其中一个的∆H更负，这可以表明该蛋白质配体复合物中参与了更多氢键。越来越多的研究人员将热力学与结构-活性关系(SAR)分析结合起来。
在另一个研究中[36]， ITC，计算和结构研究被用于描述不同的阅读蛋白，这些蛋白质特异性地识别组蛋白上的甲基化赖氨酸残基。作者使用MicroCal自动itc200获得组蛋白H3K4me3(带正电荷的甲基化赖氨酸)、H3C4me3(中性的氨基类似物)和H3G4(中性的甘氨酸，而不是4号位置的赖氨酸)多肽与5个特异识别H3K4me3 (JARID1A的PHD锌指、BPTF、TAF3和SGF29和JMJD2A皇家家族的Tudor结构域)的结合亲和力和热力学。这五个阅读器口袋在芳香笼的组成和结构上是不同的，可以检查芳香笼的各个组件对结合差异的具体影响。所有ITC结合测定的化学计量值均为1。H3K4me3和H3C4me3的对比ITC实验表明:
带正电的H3K4me3结合的强度比中性的H3C4me3 - 4(5个阅读蛋白中含有Trp作为芳香笼的一部分)强2- 33倍(JARID1A, TAF3, BPTF和JMJD2A)。
Kme3侧链与芳香笼的结合比中性Cme3侧链与芳香笼的结合焓更有利(更负)(图4)。
与Cme3基团与相同芳香袋的关联相比，Kme3侧链的关联在熵上更不利(更积极)(图4)。
ITC结合和热力学数据，以及计算和结构结果，为良好的阳离子- π相互作用的存在提供了证据，如自然发生的Kme3与阅读器蛋白的富含电子的芳香笼的焓驱动关联所示。
图3。JARIDA1A PHD3读取域(上)和TAF3 PHD读取域(下)与组蛋白H3K4me3(左)、H3C4me3(中)和H3G4(右)结合的ITC数据。每个ITC滴定图的顶部为原始数据，底部为拟合到一组位点模型的绑定等温线。KD值是插入的。组蛋白的结构在最右边。转载须授权[36]
与含有至少一种Trp残基的其他读本相比，H3K4me3和H3C4me3结合到SGF29的串联都铎结构域，具有相似的结合热力学，这表明SGF29含有Tyr/ phi的半芳香笼在Kme3的缔合中缺乏(或至少只有很小的贡献)阳离子- π相互作用(图4)。这一结果与先前的观察一致，即阳离子- π相互作用的强度取决于芳香环的性质。
图4。ITC实验的热力学数据显示了五个阅读蛋白结构域与H3K4me3或H3C4me3的结合。蓝色:∆G;绿色:∆H;红色:- t∆年代。负值是“有利的”过程，正值是“不利的”过程。经许可改编的数据[36]
这项工作提供了实验和理论证据，表明阅读蛋白主要通过良好的阳离子- π相互作用组合识别三甲基赖氨酸，并由于与三甲基赖氨酸侧链的关联而涉及水分子的释放。这一信息在合理的药物设计中具有意义，因为它可以专门针对三甲基赖氨酸阅读器的芳香笼。
染色质结合蛋白对表观遗传机制的潜在调节与许多疾病有关，包括癌症、代谢紊乱、炎症、中枢神经系统疾病和病毒感染。
表观遗传书写器、阅读器和擦除器都可以被认为是潜在的药物靶点。乙酰化和甲基化等修饰被很好地表征，对其他修饰机制的更深入了解可以导致未来的药物发现。已经有几种小分子药物可以抑制表观遗传靶蛋白，还有更多的药物仍在开发中，其中一些已经投入临床。
ITC在药物发现过程中用于命中验证、先导优化和作用机制研究。KDITC的热力学和化学计量学可用于表征药物-靶点结合并将化学命中移动到引线中[40] 20日26日．
针对特定表观遗传结构域的小分子抑制剂的开发具有挑战性，特别是对于像bromodomains这样的阅读蛋白，因为目标蛋白与同一表观遗传目标家族中的其他蛋白质共享结构域。Filippakopoulos等人(2010)[19]描述了一种与溴畴竞争性结合的细胞可渗透小分子(JQ1)。JQ1是根据已知的构效关系(SAR)研究设计的。在克隆和表达所有人类bromodomain后，他们使用差示扫描荧光法(DSF)热位移法筛选与JQ1的结合。(+)-JQ1的结合显著提高了BET家族所有溴畴的热稳定性，表明结合紧密。BET家族以外的溴域没有检测到显著的稳定性变化，这表明该配体具有高度选择性。
由于DSF的有效性和敏感性在不同的蛋白质之间可能有所不同，因此使用ITC来精确地确定结合常数。对映体纯(+)-JQ1与K结合D在BRD4的第一和第二溴畴上分别分布约50 nM和90 nM。ITC也测定了类似的结合，BRDT和BRD2的第一个溴域的结合弱3倍。此外，(+)-JQ1在ITC中没有检测到与DSF中表现出最小温度变化的溴畴结合。通过与BRD4共晶结构验证了JQ1对人类bromodomain子集的高效和特异性。
在活的有机体内研究表明，JQ1从染色质中取代了BRD4融合癌蛋白，促进了BRD4依赖细胞系和异种移植模型的鳞状分化和特异性抗增殖作用。这些数据为靶向表观遗传读本蛋白-蛋白相互作用的概念提供了证明，并为溴域家族化学探针的开发提供了新的支架。
波特等人(2014)[4]采用“凹凸孔”方法设计溴畴小分子抑制剂。作者假设他们可以使用化学遗传方法，基于溴域和已知小分子抑制剂(在本例中为I-BET)之间的工程形状互补性，最终生成高亲和力溴域-配体变体对。
溴域上一个保守的疏水残基突变为一个更小的残基，从而在蛋白质中产生一个“孔”。该突变体被一种已知抑制剂I-BET的类似物靶向，该抑制剂具有一个可以被突变蛋白容纳的空间上巨大的“凸起”。野生型(WT) bromodomain结合笨重的模拟物更弱的结果之间的空间碰撞凹凸和自然发生的残留物。作者开发了现有小分子抑制剂I-BET的乙基衍生物，并通过ITC和DSF表明，它结合亮氨酸/丙氨酸突变溴域具有纳摩尔亲和力，相对于野生型溴域具有高达540倍的选择性。ITC的结合焓也是负的和有利的。细胞培养研究表明，仅封锁第一个溴域就足以从染色质中取代特定的BET蛋白Brd4。这种方法的扩展可以帮助确定单个BET蛋白在人类生理和疾病中的个体作用。
其他研究使用ITC联合溴域抑制剂/探针筛选试验，如DSF和AlphaScreen®(9日,16日,21日,37岁,47岁,56岁,57岁的65年,82年)．
ITC也被用来测量KD其他表观遗传蛋白家族如染色体结构域的探针和抑制剂(67、72)，组蛋白赖氨酸甲基转移酶(17日42、44), WD40[66]，组蛋白脱乙酰酶(68、69)和MBT[25]．
詹姆斯等人(2013)[32]研究了组蛋白甲基赖氨酸(Kme)阅读蛋白L3MBTL3的潜在抑制剂。由于赖氨酸甲基化是一个关键的表观遗传标记，抑制甲基-赖氨酸(Kme)结合蛋白可以提高对这些调控机制的理解，并有可能验证Kme结合蛋白作为药物发现靶点。作者从抑制剂UNC1215开始，这是已知的甲基赖氨酸阅读蛋白L3MBTL3的第一个有效和选择性小分子化学探针。在这篇文章中，他们讨论了设计、合成和SAR研究，这些研究导致了一种与类似蛋白质相比具有更高选择性的新抑制剂的发现。
在这项研究中，小分子化合物与L3MBTL3结合的亲和力通过AlphaScreen®试验确定，这些结合趋势通过正交时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)试验确认。利用MicroCal Auto-ITC200也证实了感兴趣化合物的直接结合亲和力。AlphaScreen®、TR-FRET和ITC的组合在解释所报告的SAR趋势方面提供了高可信度。
化合物2和56显示出作为更具选择性的L3MBTL3抑制剂的希望，因此作者使用ITC进一步量化选择性水平，比较与两种相似蛋白质的结合(表1)。化合物1是原始化合物UNC1215。化合物2结合L3MBTL3具有更强的亲和力(KD)与L3MBTL1相比，其选择性提高了约150倍。化合物56对L3MBTL3的选择性甚至更高，ITC的选择性约为400倍。相比之下，化合物5的ITC数据发现该化合物对L3MBTL3的选择性是L3MBTL1的16倍，而化合物1L3MBTL3的选择性是L3MBTL1的78倍。从结构数据和ITC数据来看，可以通过改变二聚体结合模式中与第一和第二MBT结构域结合的胺来提高强效L3MBTL3抑制剂的选择性。
化合物5 |
化合物1 |
化合物2 |
化合物56 |
|
L3MBTL3结合AlphaScreen®IC50(µM) |
0.071 |
0.064 |
0.17 |
0.13 |
L3MBTL1结合AlphaScreen®IC50(µM) |
2.9 |
2.3 |
> 10 |
9.6 |
L3MBTL3/L3MBTL1选择性AlphaScreen® |
41 |
35.4 |
> 59 |
74 |
L3MBTL3结合ITC KD(µM) |
0.38 |
0.12 |
0.47 |
0.35 |
L3MBTL1 ITC绑定KD(µM) |
6.2 |
9.4 |
0.68 |
132 |
ITC的L3MBTL3/L3MBTL1选择性 |
16 |
78 |
145 |
380 |
表1。小分子化合物与L3MBTL3和L3MBTL1结合亲和力的正交分析结果。根据权限[32]改编的数据
利用生物物理筛选鉴定染色质结合蛋白，然后进行定量KDITC的值，是一种确定的方法来观察结合的特异性和选择性。通过适当的组蛋白肽系列，以及同一表观遗传家族的不同野生型和突变蛋白，ITC可以确定单个残基或修饰对更复杂底物的总结合亲和力的贡献。结合结合，热力学和化学计量数据从ITC，结构研究，如核磁共振和x射线晶体学，和在活的有机体内研究，最终将导致对这些复杂的相互作用的完整理解。生化筛选，ITC, SAR和在活的有机体内然后，分析可以用于合理的药物设计，以创建特定于读取器，写入器和擦除目标的抑制剂。
1.阿尔博，b.n.，科隆科，e.m.，德努，J.M.生物化学49，6375-6385 (2010) doi:10.1021/bi100381y。
2.安德烈奥利，F.，巴博萨，a.j.m，帕伦蒂，m.d，和德尔里约热内卢，A.。咕咕叫。制药公司。设计19日,578-613 (2013) doi:10.2174/1381612811306040578。
3.阿罗史密斯，C. H.，庞特拉，C.，菲什，P. V.等。Nat。评论11日,384-400 (2012) doi:10.1038/nrd3674。
4.波特。，M.G.J., Lin-Shiao, E., Cardote, T., et al.科学346年,638-641 (2014) doi:10.1126/science.1249830。
5.Berardi, A.， Quilici, G.， Spiliotopoulos, D.等。诊断。酸Res。44岁的3448-3463 (2016) doi:10.1093/nar/gkw103。
6.Botuyan, m.v.， Lee, J.， Ward, I.M，等。细胞127年,1361-1373 (2006) doi:10.1016/jcell.2006.10.043。
7.坎贝尔，r.m.，图米诺，p.j.。j .中国。投资。124年,64-69 (2014) doi:10.1172/JCI71605。
8.查克拉瓦蒂，S.，埃塞尔F，林，T.，齐格勒，Z.。生物化学54岁的5766-5780 (2015) doi:10.1021/acs. biochemistry .5b00617。
9.Ciceri, P.， Müller, S.， O 'Mahony, A.，等人。Nat,化学。医学杂志。10，305-312 (2014) doi:10.1038/nchembio.1471。
10.克拉克，医学博士，马库姆，R.，格拉弗林，R.等人。Proc。国家的。学会科学。112年,E3669-E3678 (2015) doi:10.1073/pnas.1504021112。
11.康利,J。药物。世界24-39 (2015) http://www.ddw-online.com/enabling-technologies/p303671-epigenetic-targets-:-on-the-verge-of-becoming-a-major-new-category-for-successful-drug-research-summer-15.html
12.达玛拉加，V.，李，j.h.，帕特尔，A.等。生物。化学。287年,27275-27289 (2012) doi:10.1074/jbc.M112.364125。
13.杜，J，帕特尔，d。J。Biochim。Biophys。学报1839年,719-727 (2014) doi:10.1016/j.b bbagrm.2014.04.011。
14.杜俊，钟新，伯纳塔维希特，杨伟，等。细胞151年,167-180 (2012) doi:10.1016/j.cell.2012.07.034。
15.Eram, m.s.， Bustos, s.p.， Lima-Fernandes, E，等人。生物。化学。289年,12177-12188 (2014) doi:10.1074/jbc.M113.523183。
16.费德洛夫，O.， caststex, J.， Tallant, C.等。科学。睡觉。1，E150072313 (2015) doi:10.1126/sciadv.1500723。
17.弗格森，a.d.，拉森，n.a.，蒂娜·霍华德，T.等人。结构19，1262-1273 (2011) doi:10.1016/j.str.2011.06.011。
18.菲利帕科波洛斯，P.，皮考，S.。、芒果、M。et al。细胞149年,214-231 (2012) doi:10.1016/j.cell.2012.02.013。
19.李志强，李志强，李志强，等。自然468年,1067-1073 (2010) doi:10.1038/nature09504。
20.Freire, E。药物盘。今天13日,869-874 (2008) doi:10.1016/j.d uddis .2008.07.005。
21.Gacias, M.， Gerona-Navarro, G.， Plotnikov, A. N.等。化学。医学杂志。21，841-854 (2014) doi:10.1016/j.chembiol.2014.05.009。
22.加尔斯克，A. L.，克拉逊，G.，德努，J. M.。生物化学47岁的8094-8102 (2008) doi:10.1021/bi800766k。
23.盖伊，R.，福尔科纳，R. J.和柯林斯，B. M.。J.摩尔。25日,32-52 (2012) doi:10.1002/jmr.1167。
24.何超，李飞，张俊，吴俊，石勇。生物。化学。288年,4692-4703 (2013) doi:10.1074/jbc.M112.426148。
25.赫罗尔德，j.m.，威格尔，t.j.，诺里斯，j.l.等。医学。化学。54岁的2504-2511 (2011) doi:10.1021/jm200045v。
26.Holdgate G。冰毒。摩尔。杂志。572年,101-133 (2010) doi:10.1007/978-1-60761-244-5_7，
27.霍顿，J. R.，恩斯特罗姆，A.，佐勒，E. L.等。生物。化学。291年,2631-2646 (2016) doi:10.1074/jbc.M115.698449。
28.霍顿，J. R.，阿帕德海耶，A. K.，齐，H. H.等。Nat。结构。摩尔。杂志。17，38-43 (2010) doi:10.1038/nsmb.1753。
29.伊岑，F.，格雷芬伯格，A.，博斯肯，C.A.和盖耶，M.。诊断。酸Res。42，7577-7590 (2014) doi:10.1093/nar/gku449。
30.雅各布斯S.A.和霍拉萨尼扎德S。科学295年,2080-2083 (2002) doi:10.1126/science.1069473。
31.雅各布森，r.h.，拉德纳，a.g.，金，d.s.，和纪健，R。科学288年,1422-1425 (2000) doi:10.1126/science.288.5470.1422。
32.James, L. I.， Korboukh, V. K.， Liubov Krichevsky, L.等。医学。化学。56岁的7358-7371 (2013) doi:10.1021/jm400919p。
33.杨森，韦格，陶杰，金，杰，弗莱，s。V。药物。今天抛光工艺。7,E59-e68 (2010) doi:10.1016/j.ddtec.2010.07.004。
34.金俊，史俊，刘斌，等。植物杂志。168年,1275-1285 (2015) doi:10.1104/pp.114.255737。
35.金世刚，张志明，杜内尔，谭亮，等。细胞的报道14日,493-505 (2016) doi:10.1016/j.c elep .2015.12.044。
36.坎普斯，黄俊杰，波特，等。Commun Nat。6,8911 (2015) doi:10.1038/ncomms9911。
37.Kempen, H. J.， Bellus, D.， Fedorov, O.等。脂类的见解6,47-54 (2013) doi:10.4137/LPI.S13258。
38.拉克纳，M.，奥卡罗尔，D.，雷亚，S.等人。自然410年,116-120 (2001) doi:10.1038/35065132。
39.拉德伯里，j.e.。Biochem.Soc。反式。38岁的888-893 (2010) doi:10.1042/BST0380888。
40.拉德伯里，J. E.克莱贝，G.和弗莱雷，E.。Nat.审查药物光盘。9，23-27 (2010) doi:10.1038/nrd3054。
41.细胞159，558-571 (2014) doi:10.1016/j.cell.2014.09.049。
42.刘芳，陈晓明，陈晓明，等。医学。化学。53岁,5844-5857 (2010) doi:10.1021/jm100478y。
43.刘，N.，张。，Z., Wu, H., et al.基因重击。29，379-393 (2015) doi:10.1101/ add .254425.114。
44.马，A.，于，W.，李，F.等。医学。化学。57岁的6822−6833 (2014)doi:10.1021/jm500871。
45.K.马莱切克和A.鲁亨堡。Enyzymol方法。512年,187-220 (2012) doi:10.1016/B978-0-12-391940-3.00009-3。
46.玛格丽特，R.，贾斯汀，N.，大野，K.等。自然461年,762-767 (2009) doi:10.1038/nature08398。
47.麦克卢尔，K. G.，格斯纳，E. M.，辻川，L.等。《公共科学图书馆•综合》8，E83190 (2013) doi:10.1371/journal.pone.0083190。
48.缪勒，m。m。缪尔，t。W。化学。牧师。115年,2296-2349 (2015) doi:10.1021/cr5003529。
49.Musselman, c.a.， Avvakumov, N.， Watanabe, R.等人，Nat。结构。摩尔。杂志。19日,1266-1272 (2012) doi:10.1038/nsmb.2435。
50.穆塞尔曼，C. A.，拉隆德，M. E.，科特，J.和库特拉泽，T. G.。Nat。结构。摩尔。杂志。19日,1218-1227 (2012) doi:10.1038/nsmb.2436。
51.娜迪，N. Min, J.， Kareta, M. S.等。学生物化学的发展趋势。科学。33，305-313 (2008) doi:10.1016/j.tibs.2008.04.014。
52.尼尔森，J. D.，丹尼森科，O.和博姆斯提克，K.。Nat。港。1，179-185 (2006) doi:10.1038/nprot.2006.27。
53.Org, T.， Chignola, F.， Hetenyi, C.等。EMBO代表。9，370-376 (2008) doi:10.1038/embor.2008.11。
54.帕克，L. R.山本，K. R.和藤森，D. G.。生物。化学。291年,6060-6070 (2016) doi:10.1074/jbc.M115.696864。
55.潘德,V。医学。化学。59岁的1299-1307 (2016) doi:10.1021/acs.jmedchem.5b01507。
56.Picaud, S.， strochia, M.， Terracciano, S.等。医学。化学。58，2718-2736 (2015) doi:10.1021/jm501893k。
57.皮考，S.，威尔斯，C.，费勒塔尔，I.等人。国家科学研究程序。110年,19754-19759 (2013) doi:10.1073/pnas.1310658110。
58.彼得斯，B. J. G. E，穆伦布鲁克，E.贝尔，R.和梅基诺维奇，J.。《公共科学图书馆•综合》10，E0139205 (2015) doi:10.1371/journal.pone.0139205。
59.波波维奇，R.和利希特，J. D。癌症。2，405-143 (2012) doi:10.1158/2159-8290.CD-12-0076。
60.秋,Y。，Liu, L., Zhao, C., et al.基因重击。26日,1376-1391 (2012) doi:10.1101/gad.188359.112。
61.Rajakumara, E.， Nakarakanti, n.k.， Nivya, M.A，和Satish, M.。科学。代表。6,20161 (2016) doi:10.1038/srep20161。
62.罗斯巴特，s.b.和斯特拉尔，b.d.。Biochim。Biophys。学报1839年,627-643 (2014) doi:10.1016/j.b bbagrm.2014.03.001。
63.阮娟，欧阳华，阿玛亚，马文芳，等。《公共科学图书馆•综合》7，E35376 (2012) doi:10.1371/journal.pone.0035376。
64.Ruthenburg, a.j.， Li, H.， Milne,T.A.等。细胞145， 692-706 (2011) doi:10.1016/j.cell.2011.03.053。
65.舒尔茨，D.，穆格尼尔，m.r.，保尔森，e.m.，等人。公共科学图书馆杂志。13日,E1002316 (2015) doi:10.1371/journal.pbio.1002316。
66.Senisterra, G.， Wu, H.， Allala-Hassani, A.等。物化学。J。449年,151-159 (2013) doi:10.1042/BJ20121280。
67.Simhadri, C.， Daze, K. D.， Douglas, S. F.等。医学。化学。57岁的2874−2883 (2014)doi:10.1021/jm401487x。
68.辛格，R. K.，拉尔，N.，特拉维斯S.利达尔，T. S.等。生物化学52岁的8139-8148 (2013) doi:10.1021/bi400740x。
69.辛格，R. K.，铃木，T.，曼达尔，T.等。生物化学53岁,7445-7458 (2014) doi:10.1021/bi500711x。
70.索思豪尔，s.m.，克罗宁，n.b.，威尔逊，J.R.诊断。酸Res。42，661-671 (2014) doi:10.1093/nar/gkt776。
71.斯特劳德，H.， Do, T.， Du, J.，等。Nat。结构。摩尔。杂志。21，64-72 (2014) doi:10.1038/nsmb.2735。
72.斯塔基，J. I.，迪克森，B. M.，程，N.等。化学生物。12，180-187 (2016) doi:10.1038/nchembio.2007。
73.苏X，朱G.，丁X，等。基因重击。28日,622-636 (2014) doi:10.1101/ add .233239.113
74.Tesina, P.， Cermakova, K.， horejsal, M.等。Commun Nat。6,7968 (2015) doi:10.1038/ncomms8968。
75.Vermeulen, M.， Eberl, h.c.， Matarese, F.等。细胞142年,967-980 (2010) doi:10.1016/j.cell.2010.08.020。
76.瓦格纳，e.k，阿尔博，b.n，德努，j.m。Enzymol方法。512年,161-185 (2012) doi:10.1016/B978-0-12-391940-3.00008-1。
77.沃尔特，W.，克莱因斯，D.，唐。， Y.，等。Molec。细胞。医学杂志。28日,2840-2849 (2008) doi:10.1128/MCB.01457-07。
78.王春华，张庆林，韩涛，等。Acta结晶。D71,1955-1964 (2015) doi:10.1107/S1399004715012948。
79.吴浩，曾浩，董安，等。《公共科学图书馆•综合》8，E83737 (2013) doi:10.1371/journal.pone.0083737。
80.于俊，哈尔达，M.，马利克，S.和斯里瓦斯塔瓦，D. K.。《公共科学图书馆•综合》11日,E0152467 (2016) doi:10.1371/journal.pone.0152467。
81.velazquescampoy, A.， Leavitt, S. A.和Freire, E.。冰毒。摩尔。杂志。1278年,183-204 (2015) doi:10.1007/978-1-4939-2425-7_11。
82.曾格尔，M.， Chan K. H.， Ciulli, A.。ACS化学。医学杂志。10，1770-1777 (2015) doi:10.1021/acschembio.5b00216
83.詹勇，Kost-Alimova, M.， Shi X，等。表观遗传学与染色质8，37-56 (2015) doi:10.1186/s13072-015-0026-4。
84.赵凯，哈肖，R. H.，柴，X.和马莫斯坦，R.。Proc。国家的。学会科学。101年,8563-8568 (2004) doi:10.1073_pnas.0401057101。
85.张鹏，李，H.，布伦泽尔，j.s.，和高定，J.F.诊断。酸Res。40，4237-4246 (2012) doi:10.1093/nar/gkr1235。
