6个最佳转染技巧

转染是将核酸(DNA和RNA)导入真核细胞的一项重要的细胞生物学技术。当人们想要在细胞中表达基因工程蛋白(通常通过质粒DNA转染)或耗尽内源性蛋白(通过siRNA转染)时，它特别有用。

一般来说，常用的有三种转染方法:化学转染、电穿孔(或核转染)和lenti/逆转录病毒转染。前两种方法被认为是“瞬时转染”，因为引入的核酸在细胞中的数量会随着时间的推移而减少，这是由于降解和稀释。另一方面，病毒转染将DNA合并到内源性染色体上，在细胞周期内复制，因此被认为是“稳定转染”。在本指南中，我将只关注瞬时转染方法，因为根据我的经验，这些方法比病毒转染更棘手。

有许多商业试剂盒的化学转染和电穿孔。无论你遵循的是制造商的协议还是论文的协议，如果不根据你的需要优化协议，你经常会发现很难得到令人满意的结果。以下是我认为对成功转染最有用的技巧，这是我从多年的经验和排除转染实验故障中学到的。

化学转染vs电穿孔

化学转染有许多优点。首先，它不需要仪器和试管。考虑到一个非常基本的电穿孔设备大约是1万美元，这可能是一个巨大的优势。其次，在转染所需的细胞数量上有更大的灵活性。在电穿孔技术中，使用的细胞数量很大程度上取决于试管的大小。

在这种情况下为什么要使用电穿孔呢?首先，电穿孔适用于某些难以用化学转染转染的细胞类型(例如一些原代细胞系)。其次，在我看来，协议更简单，因为你可以在分裂细胞培养时进行电穿孔。

一些额外的建议:

• 大多数商业化学转染试剂盒设计用于DNA转染或siRNA转染，但我看到许多人说任何试剂盒都可以用于这两种应用。
• 大多数公司都提供免费样品供你试用。
• 电穿孔装置也可用于将其他膜不渗透分子输送到细胞中(例如Alexa染料)。

做优化

首先，试试制造商的协议。一些制造商还提供特定于蜂窝类型的协议，所以请查看他们的网站。如果你最终看到毁灭性的细胞死亡(这经常发生)或非常低的转染效率，那么你应该优化。如果你正在做化学转染，改变DNA数量，DNA与试剂的比例，转染到检测的时间，以及生长培养基中血清和抗生素的存在(除非协议说这真的无关紧要)。在我看来，最重要的因素是DNA和试剂的数量。当我使用的DNA和试剂数量少于制造商建议的数量时，我总是能得到更好的结果。如果您正在使用电穿孔，您可以尝试不同数量的DNA，电压和脉冲持续时间。

做验证

您可以使用RT-PCR, western blot, FACS或成像来评估转染效率。我最喜欢的验证方法是用GFP质粒或荧光对照siRNA转染，用简单的10倍物镜荧光显微镜定量显示荧光信号的细胞部分。

使用高质量的DNA

质粒提取大肠杆菌在转染实验中，培养物可能被内毒素污染，从而影响细胞活力。我强烈建议使用中型或大型DNA提取试剂盒(而不是小型试剂盒)，其中包括更广泛的洗涤步骤和乙醇沉淀步骤。

使用健康的细胞。细胞的活力和健康状况也是影响转染效率和转染后细胞活力的重要因素。

• 限制通道数;我一般不会保持细胞培养超过2个月。
• 给细胞足够的时间从压力中恢复。在解冻新瓶装冷冻液后，我建议在使用前将细胞传代几次。我还会确保细胞在进行化学转染前至少在分裂后的一夜内生长。
• 要小心污染，特别是如果你的生长培养基中没有使用任何抗生素，因为它会影响转染效率。定期做支原体检测(操作非常简单)，如果你的检测结果呈阳性，或者在显微镜下看到小物体(几微米)漂浮，不要犹豫，扔掉你的培养物，解冻一瓶新鲜的冷冻原料，换掉你的培养基，PBS和胰蛋白酶。
• 不要让你的细胞培养变得过度融合。传代细胞前达到~90%的汇合。

做对照实验

这适用于任何生物学实验，但对siRNA转染实验尤其重要。用对照siRNA(不消耗任何蛋白质的siRNA)进行转染，以评估转染的毒性或任何副作用。

我希望这些建议对你有用。如果您仍然对转染结果不满意，可以考虑使用病毒转染，用可诱导的或较弱的启动子替换质粒中的启动子(以减少过度表达引起的毒性)，或在可能的情况下切换到其他细胞类型。