10条建议来优化临床流式细胞术

流式细胞术临床immunodiagnostics景观近几十年来已经改变了。¹这个复杂和强大的技术使用fluorophore-tagged抗体荧光标记细胞对各种生物标记,然后进行分析,以揭示生物标记细胞内的人口分布格局在单细胞决议。²临床的一个常见应用流式细胞术是immunophenotyping,标识的免疫细胞来帮助血液恶性肿瘤的诊断,特别是白血病和淋巴瘤。^{3 - 5}它也用来量化细胞DNA含量、⁶在儿童淋巴细胞白血病,^7、8这与患者的结果。此外,它是有用的分析对治疗的反应和检测残余肿瘤细胞治疗。⁹

免疫疾病治疗是另一种流式细胞术的临床应用,它是用来识别CD4 +和CD8 + t细胞感染艾滋病毒后子集¹⁰或诊断原发性免疫缺陷。¹¹它可以揭示某些免疫细胞的存在子集后同种异体骨髓或造血干细胞移植。^12、13一个新兴临床应用流式细胞仪使用fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)收集细胞后分析满足某些表型标准,隔离干细胞移植或细胞疗法。¹

临床应用流式细胞术进行验证协议,已被精心设计考虑最优荧光团组合来减少光谱重叠和足够的生物标志物识别感兴趣的人群。此外,罕见的细胞群之间的平衡与荧光团亮度确保利益的人口将是明显的。流式细胞术有几个优点,如:(i)单细胞分辨能力,使识别罕见的细胞亚群在一个异构的人口,这可能对疾病诊断有重要影响,2(2)多路复用,同时检测多种生物标志物,¹⁴(3)复杂但健壮的仪器和软件处理方案一致的性能和易用性的数据分析,(iv)快速样品处理提前通知疗程。

校准是至关重要的

重要的是要保持优秀的流式细胞分析仪的工作状态。这意味着日常仪器校准和标准化是必要的,以确保一致性不同天,收集的数据来验证机器正常工作。^2、15这可以通过运行一个校准检查参考珠子,精心准备与小bead-to-bead变异窄的公差范围内,根据制造商的指示,所有的颜色。这个过程测试仪器的灵敏度和线性度,确保珠子的平均荧光强度下降在正确的目标范围内为每一个激光仪器。这个过程是自动的在大多数现代流血细胞计数器和所有测试参数的仪器产生读出。

颜色补偿

共轭的荧光团中使用的抗体流式细胞术相对广泛的激发和发射配置文件(图1)。结果在激光激发的荧光团之间的“相声”旨在激发特定的荧光团“a”无意中导致一些信号为“a”“B”的通道。²颜色补偿是一个过程,消除或最小化这个相声和珠子应该执行共轭荧光团的每个试验将雇用加上负控制根据制造商的指示。

图1所示。说明排放概要文件之间的光谱重叠异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)。波长488纳米的激光,用于激发FITC,导致FITC发射泄漏到带通(BP)过滤范围为PE(蓝色箭头所示),导致体育频道的信号。

考虑控制

珠子的光学参数不同免疫细胞的光学参数。因此,一旦执行质量控制,它是可取的运行assay-specific控制使用先前的时间设置试验运行。在这个阶段,调整可能会对光电倍增管电压(PMTV)向前散射(FSC)和侧散射(SSC)淋巴细胞上规模。接下来,应该执行控制使用:(i)清白的消极的细胞,这将低于先前建立的阈值对阳性细胞的荧光通道,为每一个荧光团(2)染色阳性控制用于试验,这应该属于规模高于阈值,和(3)同形像抗体控制,低于阈值。调整为每个荧光团PMTV颜色可以应用于改进正面和负面的位置控制。

样品加入和处理

正确的样本处理需要妥善记录样品到实验室的信息系统,并指出使用抗凝剂,因为它可能影响流分析,并选择一个方法来溶解红细胞。²live-dead染料分辨活细胞死的很重要,因此限制了分析活细胞和排除死亡细胞的分析,这可能autofluoresce并导致背景噪音。¹⁵如果只有染色细胞表面受体,可以使用新鲜细胞和膜完整性染料可以用来区分活细胞死亡的。²如果还为胞内蛋白染色,染色表面受体前需要进行固定,为细胞内染色透化作用。此外,预处理和可以解决的可行性染料将live-dead歧视自固定过程permeabilizes细胞所必需的,因此排除了使用染料膜完整性。¹⁶

一致性是关键

流式细胞术是一个敏感的技术,可再生的实验,实验的结果是很重要的限制的变化,甚至在微妙的实验参数,如温度细胞保持在,抗体染色过程的接触antibody-conjugated荧光团。

试剂验证

尽管试剂准备严格的标准,批次变化仍然会出现。此外,储存条件和运输和处理过程可能影响等敏感试剂抗体。确保试剂如预期的行为,试剂验证可能是由:(i)直接比较的分析参考资料,(ii)的并行测试旧与新试剂,如重叠测试开立新试剂瓶/管,和(3)与控制,例如通过使用商业QC细胞样本。²抗体浓度对新批次可能验证抗体滴定到细胞,例如,淋巴细胞,证实用于检测抗体的浓度。此外,良好的记录,如注册截止日期和批号试剂也可以帮助减轻差异引起的存储和时间。

数据分析

有很多方法来执行收集的数据进行的分析,通过流式细胞术和多种格式来显示数据。仔细考虑数据完整性和特定方法的基本原理的分析需要完成,以确保它符合临床试验的需要。一旦建立一种数据分析方法,是很重要的分析结果以同样的方式对相同类型的临床流测试,例如,immunophenotyping前体b细胞淋巴细胞白血病,为了获得一致的结果。这包括:(i)浇注过程,这一过程决定第一个荧光通道分析认为,²(2)正确标签的数量(例如,细胞前体b细胞),(3)注释的数量占总事件或人口的比例是封闭的,和(iv)规模用于绘制结果的类型,例如,对数和bi-exponential (HyperLog或“Logicle”)。^{2、15、17、18岁}

感知模式

成为善于识别非常重要的细胞群分布模式疾病患者健康的样本,样本可辨别的,脱颖而出。熟悉的预期模式分布细胞也有助于理解一个问题是否发生在当天早些时候以来仪器校准和标准化,如细胞内流湍流引起的残骸,这可能会影响结果。

保护病人的身份

由于病人隐私,重要的是要确保样品和数据保密和安全。可以促进这个密码保护和加密措施。此外,数据完整性和备份,防止数据丢失也是必不可少的保障。记录记得更新流校准后血细胞计数器可以存储质检报告,制作QC历史直接访问观察趋势随着时间的推移。另外,Levey-Jennings情节可以利用分析质量控制数据的进化。²QC值持续超出范围或持续高于或低于平均值可能表明一个仪器故障或漂移。

免责声明:我们不是以任何方式指导临床流应该如何被执行,而只是提供一个教育指南。

引用

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