乔纳斯Korlach告诉我一个故事。
的故事他如何帮助开发单分子实时(SMRT)测序技术已成为一个主要的基因组学,在超过1400个出版物仅在2017年。Korlach,现在的首席科学官太平洋生物科学(PacBio),坚信SMRT测序研究的方向。Korlach如何从一个想法SMRT笔记本一个成熟的基因组技术?
水晶革命
故事开始的1997年,康奈尔大学。Korlach,然后一年级研究生,已经在生物合成和高分子杰夫•罗伯茨现在Robert j . Appel教授康奈尔大学分子生物学和遗传学。90年代末”是一个非常激动人心的时刻在分子生物学、“Korlach说。“所有这些论文对高分辨率的晶体结构,所有这些大分子的机器。
这是一场革命,因为在此之前,都是带胶,我们看在本科期间,你必须间接推断这些酶是怎样工作的。这是现在取而代之的是图片这样,”他说,指着下面的图像,晶体结构的T7 DNA聚合酶从二十年前发表的一篇论文。这绝对是一个加强从乐队凝胶。
“在我这是令人兴奋的,我们现在有一个很好的理解这些分子的形状和几何。”
但是分子不是静态的,甚至最详细的图像不能给信息分子如何在细胞功能;动画基于晶体结构试图显示分子的运动,但这些动画的运动都是科幻小说。Korlach相信研究可以追求更好的东西。
分子机器的运动
“我怎么可能感兴趣看看这些令人难以置信的大分子的机器使生活工作的基本过程,实时,并试图找出这些东西如何实时移动,“Korlach说。他决定开始学习的一个最令人印象深刻的“机器”在生物学、DNA聚合酶分子。DNA聚合酶是负责复制DNA分子,使用已经存在的分子作为模板。给我们的DNA是遗传代码的完整基础,聚合酶能够做这个过程几乎没有犯错的余地,只是难以置信的速度。
Korlach聚合酶的表现感到惊讶:“这是数亿年的进化演变,这是非常准确的,它是高度进行的。很明显,它可以“序列”,意思是复制,基因组中所有的基地,因为否则我们就有大麻烦了。它没有任何偏见,很快,在你身体这个过程会以每秒1000个碱基。非常节俭的,它只需要一个核苷酸基本上解码是什么另一方面通过GC /碱基配对,身体非常小,所以它可能有助于非常高的多路小足迹。”
Korlach得出结论,如果只有你可以看到DNA聚合酶做难以置信,evolution-assisted工作,那么您可以简单地让酶繁重和做笔记的性能来创建一个高质量的测序技术。
在当时这是白日梦比实际的计划。可用显微镜只有力量的观点至少500分子的聚合酶,这将创建一个非常混乱的信号掩盖了实际排序过程。
幸运的是,Korlach公司很好。博士学位顾问瓦韦伯,开创性的生物物理学家已经广泛地以他的工作在创建两个其他分析技术,荧光相关光谱和多光子显微镜当Korlach加入了他的实验室。韦伯帮助Korlach开始跟史蒂夫·特纳,隔壁实验室的研究生世界领先的纳米加工专家哈罗德·克雷格黑德。特纳现在PacBio的首席技术官。这一开始的一系列实验,旨在创建一个显微镜,实际上,比目前更加强大一千倍。最终产品的尝试zero-mode波导,PacBio测序技术的基础。
纳米显微镜
“zero-mode波导是一种最简单的纳米结构,可以想象,“Korlach说。他不是遥远。ZMW,从本质上讲,一个难以置信的铝制金属板上的小洞,直径150纳米。人的头发大约75000纳米。这是一个非常小的洞。
但如何(诚然,真的很小)洞使一个可行的显微镜吗?Korlach建议相当优秀,如果意想不到的类比;厨房的微波炉:“你知道你的微波炉门金属屏幕中间有孔吗?的目的,这样你就可以浏览到微波炉里,看看你的食物烹饪,但金属屏幕防止微波辐射的微波和烹饪。“微波电磁波谱的结实的保镖,在厘米波长范围。Korlach解释说,这些笨重的电波不能适合通过屏幕小孔径烤箱门,和指数衰减冲击,同时可见光,在相对苗条的波长400 - 800纳米,可以很容易地从内部反弹的微波通过屏幕上你的眼球,这意味着你可以很高兴地拉了一把椅子,看你的晚餐煮而不被融化了。
不幸的是,可见光正是需要可视化Korlach显微镜的意义一个很小的微波炉的门是必需的。zero-mode波导本质上是micro-microwave门。ZMW内DNA聚合酶的分子,在模板DNA测序,吸附的底部基础,核苷酸与荧光分子连接释放到ZMW室。像我们的微波炉门屏幕,ZMW的小孔径阻止光线,照耀在ZMW从下面通过。相反,只有最底部的检测室由腐烂的光,达到意义的DNA聚合酶分子,无论基地目前它可以照亮和检测。这意味着波导腔可以布满核苷酸,但只有那些在zeptoliter(10-21)体积是可视的。如果4碱基组成DNA可以每个标签不同荧光颜色,然后通过阅读时出现的彩色闪光荧光基地受到光源,相应的基地可以破译。
固定荧光
问题解决了吗?不完全是。荧光标记Korlach了可视化基地固定在大致相同的基本分子聚合酶,地位大大降低测序过程的效率。此外,荧光标记仍将附加即使在聚合酶增加了固定在底座上,迅速转移到下一个核苷酸——填充ZMW室的不受欢迎的颜色。这个问题需要一个非传统的解决方案,所以接下来Korlach告诉我看起来非常合适:“所以的想法不同类型的核苷酸在圣达菲来找我一个印度餐馆。“尽管Korlach没有在一张餐巾纸上写下的解决方案,他很快勾勒出一个答案在他的笔记本:“我意识到,检测可能是荧光团的另一个可能性是连接到另一端的分子基础。”这个新位置阻止荧光标记阻碍聚合过程,并允许标签聚合发生后漂走。
smrt测序吗?
Korlach使得这一切听起来很简单,但很明显,年的工作已进入完善技术。PacBio已经变成很简单的细节描述和调整他们的核苷酸,聚合酶和荧光团一个商业产品。PacBio的最新产品,续集系统,有一百万这些潜在的测序网站,产生一个光显示基因组数据。当然,PacBio测序市场并不孤单,Korlach似乎很热衷于他SMRT的技术潜力与竞争对手竞争技术。当然有很多研究人员,同意他的评估。SMRT测序已经变得非常流行,近年来,在著名的研究工作包括知名的描述猿和考拉基因组,甚至被用来戳孔的称赞CRISPR基因编辑技术。
Korlach认为兴奋在他跨几个测序技术归结为其一致的性能参数:“在测序中,有四个不同的标准,你想看看当你评估任何测序技术,真的,我已经上市了。你想问,“是读多久?如何准确的读吗?有偏见吗?并且可以检测化学改性的方法?”
Korlach说,满足这些标准,才可能与聚合酶的帮助他花了几十年研究:我们最初希望在20年前,现在已经意识到,那是由于DNA聚合酶酶的性质,我们为客户提供了最好的性能在所有四个区域同时”。
