琼脂糖凝胶电泳原理及其应用

简单的物理定律表明，当电流作用于含有带电物种的介质时，这些物种会向相反的电荷移动。根据它们所通过的媒介，其他特征——比如存在的物种的大小——也会影响它们的运动，导致分离。这是电泳技术(如琼脂糖凝胶电泳)的基础，这些技术广泛应用于生命科学领域。

在这篇文章中，我们将考虑琼脂糖凝胶电泳是如何工作的，如何解释它以及它的一些目的。

什么是电泳?

电泳是一种利用电流来分离DNA、RNA或蛋白质的技术，该技术基于它们的物理性质，如大小和电荷。

什么是琼脂糖凝胶电泳?

琼脂糖凝胶电泳是电泳的一种形式，用于分离核酸(DNA或RNA)片段基于他们的大小。当电流作用时，带负电荷的DNA/RNA通过琼脂糖凝胶的孔隙向凝胶带正电荷的一端迁移，较小的片段迁移得更快。由此产生的条带可以用紫外线(UV)光进行可视化。

RNA,¹然而，它倾向于形成二级结构——有时同一个片段有多个不同的物种——这影响了它的迁移方式。因此，观测到的条带并不总是代表它们的真实大小，图像是模糊的。天然琼脂糖凝胶(条件不破坏被分析物的自然结构)因此倾向于不用于RNA大小的分析，尽管它们可以给出数量和完整性的估计。备选方案包括northern和变性琼脂糖凝胶电泳²使用条件能够破坏二级结构．

琼脂糖凝胶也可用于分离蛋白质^3.根据它们的大小和电荷(不像DNA/RNA，蛋白质的电荷根据所加入的氨基酸而不同)。然而，由于琼脂糖凝胶的大孔径，蛋白质经常被分离聚丙烯酰胺凝胶相反，它们有更小的孔隙，为小蛋白质分子提供更高的分辨率。

因此，我们将重点放在DNA琼脂糖凝胶电泳在本文的剩余部分。

凝胶电泳是如何工作的?

琼脂糖是琼脂的组成部分。它形成了一个三维凝胶基质，螺旋琼脂糖分子在氢键的超螺旋束中，具有分子能够通过的通道和孔隙。当加热时，这些氢键断裂，使琼脂糖变成液体，并允许它在重置之前倒入模具(图1)。

图1: 琼脂糖凝胶中孔隙的形成和温度诱导的状态转变。

的琼脂糖百分比凝胶中所含的物质会影响孔隙大小，从而影响可能通过的分子的大小和它们通过的速度。琼脂糖含量越高，孔隙尺寸越小，分子的通过能力越小，迁移速度越慢。在分子生物学实验室中，0.7-1%琼脂糖凝胶通常用于日常的DNA分离，在0.2-10 kb范围内提供良好、清晰的片段分化。较大的碎片可以使用较低百分比的凝胶分解，但它们变得非常脆弱，难以处理，而较高百分比的凝胶可以提供更好的小碎片分辨率，但很脆，可能凝固不均匀。

由于DNA是肉眼不可见的，一种嵌入染料，如溴化乙锭(EtBr)在凝固过程中加入到凝胶中。这结合了DNA，并在紫外线下发出荧光，使DNA片段可见。DNA越多，条带越亮。

将与负载染料混合的样品置于浸没在流动缓冲液中的凝胶的一端。然后电流通过凝胶罐两端的电极通过凝胶(图2)。

图2: 琼脂糖凝胶电泳装置的插图。琼脂糖凝胶放置在缓冲槽中，与负载染料混合的样品被放置在凝胶一端的孔中，并施加电流使带负电的DNA向正极(阴极)移动。

当样品运行足够远以获得足够的分离时，凝胶从罐中取出并放置在紫外线灯箱上。插层染料可以使样本条带可视化，并与已知条带大小的DNA阶梯相比较确定其大小。迁移距离和碎片大小之间的关系是非线性的，这增加了将大小标记作为指导的重要性(图3)。

图3: A)上图是DNA电泳的典型结果。在左边，有一个大小标记，用作样本DNA片段长度的参考(以碱基对为单位)。标记的右边是三个样本:样本A，样本B和样本c。图像显示了较小的DNA片段如何比较大的DNA片段在琼脂糖凝胶中移动得更远。B)图像右侧的图表显示了DNA片段的大小与迁移距离之间的非线性关系。这是一条负曲线，当DNA片段变大时，它们在凝胶中的移动距离就会变短。资料来源:Mckenzielower，转载于Creative Commons Attribution-Share Alike 4.0 International许可证。

DNA凝胶电泳步骤，凝胶电泳机，电泳缓冲液和电分离

有几个关键步骤⁴参与选择，设置，运行和分析琼脂糖凝胶，我们现在将考虑。

1.确定所需的凝胶百分比- 0.7- - - - - -对于大多数应用，1%的琼脂糖凝胶通常是足够的，但选择适合您的样品和预期片段大小的百分比是很重要的。将琼脂糖粉与上述原料混合缓冲输入用于运行凝胶和加热融化混合物，避免沸腾。三乙酸乙二胺四乙酸(TAE)或三硼酸EDTA (TBE)⁵通常是首选的缓冲液，因为三酸溶液是轻微基本条件下的有效缓冲液，保持DNAdeprotonated可溶于水。EDTA,一种螯合剂，使核酸酶失活，这可能会破坏被分析的DNA。

2.倒凝胶-选择所需尺寸的凝胶铸造模具和梳子，为所有样品和梯子提供足够数量的孔，并提供孔容量以容纳每个待加载样品的数量。用铸造框架或胶带固定模具的开口端，在凝胶凝固时将其固定。添加DNA插层染料进入模具底部-对于EtBr, 0.2-0.5µ通常使用G /ml。EtBr是突变原的证据仍然目前讨论但结果是，许多实验室已经转向了替代品⁶比如GelRed。加入凝胶，注意不要填满模具，并确保插入染料混合均匀。不要在太热的时候倒凝胶，否则模具可能会变形或破裂。

3.将样品/梯子与装载染料混合- - - - - -加载染料执行多种功能。它们可以让用户看到原本无色的样品在哪里，使其更容易准确地将样品移液到井中，从而降低了样品在井间交叉污染的可能性。当凝胶运行时，染料随着样品迁移，使用户能够判断样品在凝胶中的位置，并防止它运行太远而丢失到缓冲液中。未加载染料的DNA样品在加载时也倾向于分散到运行的缓冲液中，因为它们的密度较小。因此，大多数负载染料都含有甘油或环氧树脂，这使得样品-染料混合的密度更大，所以它会沉淀在孔底。溴酚蓝是一种流行的着色剂，但有些还含有二甲苯氰醇等额外的染料。虽然可以购买装载染料，但许多实验室选择自己制作。⁷

如果您正在运行非常小的样本量(例如，小于5µL)，加一点可能是有利的水在此阶段使其更容易有效和均匀地加载凝胶井。同样地，如果你期望某些样品中的DNA浓度比其他样品高得多，在这个阶段也可能有必要向这些浓缩样品的样品-染料混合物中加水。如果不这样做，这些波段在可视化过程中给出的强信号可能会掩盖较弱的波段，或者要求强波段过度曝光以查看较弱的波段，从而在凝胶图像上产生明亮、扭曲的区域。

4.装入凝胶-从凝胶中取出浇注框架/胶带，并将其放入凝胶罐中，确保孔位于负端(黑色电极)。用流动缓冲液(TAE或TBE)填充容器，使凝胶浸没。小心地取下梳子，轻轻地将染色样品(如果使用了水)移液到孔中。尽量避免用移液管的尖端接触孔的边缘，因为它们可能会破裂，让一个样品流入下一个样品。过载井也会产生同样的结果。大量的DNA也可以减缓跑步过程中的DNA迁移。负载标记梯子，最好在样本行的两端各有一个。凝胶可能并不总是在一条完美的直线上运行，所以在两端有一个梯子，可以更容易地确定存在的碎片的大小。各种各样的梯子可供不同的尺寸指示;选择一个最适合您期望看到的片段大小。

5.运行凝胶-将电极从黑色到黑色，从红色到红色，将盖子放在水箱上，并将电极插入电源包中，也是黑色到黑色，红色到红色。这个和凝胶罐一起组成了凝胶电泳机．确保电极和盖子的位置是正确的，否则你的样品会从孔中反向跑出并进入运行缓冲液。设置凝胶运行的时间和电压;120伏35分钟是一个很好的近似值，但这应该根据使用的凝胶百分比和预期分离的碎片大小进行调整电分离．对琼脂糖凝胶施加电流会使其升温，电压越高，温度越高，因此当运行低百分比的凝胶时，建议使用较低的电压以防止熔化。人们很容易通过增加电压来让凝胶运行得更快。然而，这可能会导致“笑脸凝胶”，即带子两端向上弯曲，很难确定正确的带子大小。这是凝胶开始轻微融化的地方，使带子不均匀地运行。这也会导致条纹看起来模糊和模糊。

6.可视化-一旦样品在凝胶中运行了大部分(染料前面会使其可见)，关闭电源包。戴上手套，轻轻从罐中取出模具中的凝胶，沥干多余的运行缓冲液，转移到合适容器中的UV箱中进行可视化。更换手套以防止周围表面，门把手等被凝胶或运行缓冲液的插入染料污染。如果下游应用需要DNA片段，可以将相应的带放在暗室的紫外线灯箱上，用手术刀刀片从凝胶中仔细切除。在灯箱打开时，请戴上防紫外线面罩，并遮住皮肤，以防止紫外线伤害皮肤或眼睛。

如何阅读凝胶电泳

琼脂糖凝胶可以在暗室的紫外线灯箱上观察，也可以使用与相机相连的独立灯箱。无论使用哪种系统，紫外线都从下面穿过凝胶，DNA带会发出荧光，这要归功于与凝胶结合的插层染料。这可以用一个带有专门的紫外线过滤器的相机来记录。标记梯子有一个指南，说明它们包括的每个带的大小。通过将其与样本通道中的条带进行比较，可以确定条带的大小。样品间DNA的相对数量也可以进行比较，因为DNA浓度越高，条带越亮。图4显示了一个示例。

图4: 琼脂糖凝胶(2%)分析从有肺部症状的患者的支气管肺泡灌洗(BAL)诊断标本中提取的DNA pcr扩增产物。来源:美国疾病控制与预防中心。

凝胶电泳的目的是什么?

有许多原因可以解释为什么需要分离DNA片段，其中许多原因在生命科学学科中广泛适用。让我们考虑一些共同的目的。

• 样本DNA可视化
  分离和可视化DNA片段允许用户确定:
  
  样本中是否存在DNA-这可以确认，例如，如果DNA提取或聚合酶链反应在一个诊断测试因此可以确定样品是阳性还是阴性。
  
  DNA片段的大小-例如，如果进行PCR或限制性内切酶切，条带大小是否符合预期?这可以确认基因工程实验是否成功，或者可能表明存在或不存在基因插入、缺失⁸或者重复区域⁹这可以作为一些遗传疾病的诊断工具。当准备DNA时新一代测序，重要的是，文库制备的DNA片段大小正确，以便有效测序。
  
  DNA的数量虽然有更精确的方法来精确DNA量化,¹⁰如紫外可见光谱在美国，当在凝胶上测试样品时，产生的条带的强度可以大致了解样品中相对于其他样品的DNA数量。
  
  样品多干净啊-虽然在某些情况下，例如在运行整个基因组DNA时，可能会期望有一个模糊的条带，但从PCR或限制性内切中，通常可能期望有一个清晰、清晰的条带。弥散条带或涂片可能表明PCR条件或引物不理想，消化不完全或存在干扰污染物，如DNA样本中的RNA。
  
• 分离DNA片段进行纯化
  下游应用需要DNA片段，比如克隆，¹¹或以下限制消化，从总样本中分离出特定大小的DNA片段可能是可取的。为了达到这一目的，可以将消化或放大的样品放在凝胶上，并切除含有感兴趣片段的凝胶片。清洁包和方案^12，13可用于在进行下游步骤之前从琼脂糖凝胶中纯化DNA。
  
• DNA片段分离用于Southern印迹
  南部的印迹是一种用于检测样本中特定DNA序列的技术。为了做到这一点，DNA片段首先必须通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后才能探测目标序列。
  
• 电泳迁移率漂移测定(EMSAs)
  EMSA,¹⁴也称为凝胶位移分析，用于检测蛋白质和核酸之间的相互作用。的绑定就是一个例子转录因子¹⁵促进或阻止基因表达。当蛋白质与DNA片段结合时，它会改变它在琼脂糖凝胶中的迁移方式，产生“位移”。因此，通过运行不同的DNA片段组合，有或没有一个假定的DNA结合蛋白，可以确定结合发生或没有发生，从而确定目标序列。

DNA琼脂糖凝胶电泳术语

术语	定义
琼脂糖凝胶电泳	琼脂糖电泳在琼脂糖基质中用于分离大分子，如DNA片段的一种电泳方法
螯合剂	一种与金属离子反应形成稳定的、水溶性金属复合物的化合物。
变性琼脂糖凝胶	琼脂糖凝胶在破坏DNA、RNA或蛋白质的自然结构的条件下运行，导致它们展开。
去质子化	质子的去除(H+）.
DNA阶梯/标记阶梯	一种已知大小的DNA片段溶液，可用于推断未知样本中片段的大小。
电分离	利用电流分离生物分子，如DNA、RNA或蛋白质，根据它们的大小和/或电荷。
电泳	一种利用电流根据DNA、RNA或蛋白质的大小和电荷等物理性质来分离它们的技术。
电泳迁移率变化分析(EMSA)	emsa也被称为凝胶位移分析，是一种基于电泳的技术，用于检测蛋白质和核酸之间的相互作用。
凝胶电泳机	用于进行凝胶电泳的设备，通常由凝胶罐和连接电极的电源组组成。
插层染料	结合双链DNA的染料，使它们在紫外光下可见。
加载染料	电泳染色剂一种用于制备DNA阶梯和电泳样品的染料，可使其肉眼可见，并增加其密度以防止分散
诱变剂	导致DNA复制错误的化学或物理现象。
天然琼脂糖凝胶	琼脂糖凝胶在允许保存生物分子(如DNA、RNA或蛋白质)自然结构的条件下运行。
北部的污点	一种用于检测样品中特定RNA序列的技术，该技术利用电泳进行样品分离。
核酸酶	裂解核酸(如DNA或RNA)的酶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳	在聚合丙烯酰胺基质中用于分离大分子，如核酸和蛋白质的一种电泳形式
限制消化	根据周围的DNA序列，使用酶在特定位置切割DNA的过程。
运行缓冲	用于填充凝胶浸没并将运行的槽的缓冲液。它有助于保持稳定的条件。
二级结构	由相邻残基间静电吸引而形成的多肽或多核苷酸的三维结构。
印迹	一种用于检测样品中特定DNA序列的技术，该技术利用电泳进行样品分离。
转录因子	参与DNA转化或转录为RNA过程的蛋白质。

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