低温电子显微镜:原理、优点、局限性和应用程序

低温电子显微镜(低温EM)已经彻底改变了我们对复杂的分子机制的理解管理的生活。这种先进的成像技术使科学家同行进入微观世界以前所未有的清晰度和细节,揭示隐藏的结构蛋白、病毒和细胞组件。与它的起源源于科学家像雅克Dubochet的开创性工作,¹约阿希姆·弗兰克²和理查德·亨德森³低温新兴市场已经发展成为一个强大的工具,得到了许多荣誉,包括2017年的诺贝尔化学奖。⁴

低温EM是一种先进的成像技术用于阐明生物分子的三维(3 d)结构和复合物near-atomic决议。在这个技术,样品快速冷冻温度低于-150°C,被困在玻璃冰。样品从不同角度拍摄使用电子显微镜,一束电子穿过样品,导致一系列的二维(2 d)预测。先进的计算算法被用来重建三维模型的样本从这些预测。^5,6,7

低温EM显示一系列重要的差异相比convential EM,使得一个强大的工具为结构生物学,提供见解之前无法涉及的领域的研究。两种方法之间的主要区别是列于表1。^5,6,7

表1:比较convential EM的主要特性和低温。

低温电子显微镜的发展(图1)是传统的限制的结果。自从出版的首部3 d结构生物标本获得使用EM 1968年,⁸科学家们试图找到策略来规避该技术存在的主要问题,即:、样品高能电子束,所造成的破坏⁹本机结构的改变和代undesiderable工件来源于样品制备过程¹⁰和低分辨率强衍射。

几个解决方案开发评估这个问题,包括使用重金属盐嵌入示例¹¹或更换水样品中葡萄糖的解决方案,以减少在分析样品损失。³在这种背景下,一些科学家认为冷却样品低温下将避免水分蒸发,减少电子辐射造成的损害。然而,这种方法意味着水晶冰的形成在示例中,它有两个主要undesiderable效应:冰晶可以诱导损伤样本结构和他们也引起强烈的电子衍射,可以显著降低分辨率。¹²

低温EM时代开始于1980年代早期的发展应用的一种方法一瞬间冻结方法,快速冷却的样品在温度低于水的玻璃化转变温度(约-140°C)内毫秒。这个过程避免生成晶体的成核和无定形冰这一过程称为“玻璃化”。¹

在1990年代,建立了一个新的策略来改善低温EM决议由许多相同的副本平均图像标本。¹³里程碑,加上最近的技术进步,如直接电子探测器的发展和更好的计算方法,导致改善成像功能,彻底改变了。⁶因此,在过去的几十年里,出现了低温EM技术能够与传统的竞争结构技术,如x射线晶体学或核磁共振(NMR)谱。

图1: 时间轴显示低温EM的历史发展。信贷:技术网络。188金宝搏备用

低温EM工作流(图2)开始准备样品,通常一个纯化蛋白质或复杂的解决方案。样品溶液放置到一个专门的网格,然后迅速冷冻,使它变成一个低温液体,如液态乙烷。这将水转化为无定形冰,导致样品的玻璃化保存本机结构的蛋白质。玻璃化过程可以执行不同的方法后,其中一些优化捕捉短暂的分子状态。^14,15

接下来,陶瓷样品放置在网格和转移到低温EM显微镜在保持在极低的温度下保存样品的完整性。显微镜是校准对齐,和数据采集的开始。电子束是针对样本,产生一系列的二维投影图像从不同的角度。这些2 d图像处理正确的文物,提高信噪比。单个粒子通过识别图像中的粒子挑选,和一个大数据集收集的粒子。计算算法被用来重建三维粒子图像密度图。生成的3 d密度地图提供了一个表示电子的散射强度的样本,允许科学家获得洞察其结构。原子模型拟合密度图和精制迭代代表实验数据准确。精致的模型进行验证和分析理解研究分子的结构特点。^{5,14,15,16,17}

图2: 典型的低温EM工作流。来源:Hiramano92,复制 创作共用署名4.0国际4.0 (CC)许可证。

使用低温液体样品的玻璃化,最低温EM的definitory特性,可以应用到传统常规EM的变体:透射电子显微镜(TEM)和扫描电镜(SEM)。这意味着低温EM可以分为两种主要类型(图3),比较总结在表2:

• 低温TEM:在这个技术,陶瓷样品被加载到高真空TEM仪器。在TEM,电子束产生和导演到样品。当光束穿过样品,它与电子相互作用,导致散射和吸收。这种交互导致投影图像探测器的形成,获取样本的二维结构信息。获得3 d结构,多个投影图像采集的样本在不同倾斜角度在显微镜。然后使用先进的计算算法处理这些图像生成的3 d密度图样本。这个密度地图代表样本内的电子分布,并提供洞察分子的原子排列。¹⁸
  
  
• 低温扫描电镜:这种技术用于研究陶瓷样品的表面结构和地形。玻化样本通常是骨折或裂解暴露其内部表面,然后转移到SEM乐器。这个显微镜生成一个聚焦电子束扫描样品表面。随着电子束与样品相互作用,中等和背散射电子发射,然后检测并用于创建一个图像样本的表面。¹⁹
  
  

图3: 与低温TEM图像获得的例子(左)和低温扫描电镜(右)沙门氏菌Senftenberg(上一行)和牛痘病毒(较低的行)。信贷:改编自戈尔丁et al ., 2016年, ^20.复制下创作共用署名4.0国际4.0 (CC)许可证。

表2:比较低温TEM和低温扫描电镜的主要特点。

	低温TEM	低温扫描电镜
设备	透射电子显微镜	扫描电子显微镜
电子束	它是通过样本	它是集中在表面
样品厚度	薄的样品	任何厚度
信息 获得	样品的内部结构	样品的表面形貌和形态
决议	高分辨率(near-atomic)	低分辨率
应用程序	分子结构和交互 适合单粒子分析	表面特征 适合大规模的结构或材料

低温电子断层扫描(低温等)技术相结合的原则,低温EM和断层,它尤其有用研究细胞和亚细胞的三维结构。这种方法是基于一系列图像的采集标本的不同倾斜角度对电子束。收集到的不同平面结合使用计算算法重建的三维结构。^7,15,21,22

低温的典型工作流等类似的低温EM(图4),包括隔离的生物样品的制备,通过玻璃化保存。样本被放置在一个网格,形成一个薄层,然后网格转移到cryo-TEM显微镜获得的样本图像从不同角度倾斜网格。捕获的图像构成层析数据集,它包含一系列的二维预测的样本,从不同的方向提供关于其结构信息。这些2 d的预测是一致的和纠正以减少任何偏差或失真,最后,采用迭代算法和加权投影重建3 d x线断层照片。这个x线断层照片进行分析,以了解关于样品的结构和组织。有时,为了提高执行subtomogram平均信噪比和提取信息的高分辨率x线断层照片的特定区域。^{21,23,24,25,26}

图4: 一个典型的低温等工作流程。信贷:技术网络。188金宝搏备用

低温等的优点包括研究完整的细胞和组织的能力,保留不同的细胞组件之间的空间关系。它提供3 d信息nanometric决议也适用于研究细胞内动态过程,因为它允许的时间分辨成像捕获结构会随着时间而改变。另一方面,这种方法也有一定的局限性,其中大部分是典型的低温,如复杂的样品制备或使用低剂量电子束的必要性,以避免样品损坏,导致较低的信噪比。另外,样品厚度的范围仅限于~ 500 nm和倾角是有限的所以信息部分。^7,21,25,26

所有这些特性使低温等更适合研究细胞结构在其原生环境,而低温EM提供单个大分子复合物的高分辨率成像,提供原子水平的细节。这两种技术往往是互补在解决不同生物的问题,从分子结构到细胞组织和动态。

低温新兴市场已经成为一个强大的技术在结构生物学,提供几个优点和限制:^{6,14,15,16,17}

的优势

• 高,near-atomic分辨率成像。
• 样品保存使样品在他们的母语国家的研究。
• 它可以应用于广泛的生物样本,包括蛋白质、病毒、细胞和组织。
• 它可以应用到大型的研究,灵活的复合物和总成,是其他技术的挑战。
• 它使单粒子分析没有大小限制和结晶的必要性。

限制

• 它需要特定的人口同质性的粒子来实现高分辨率的决心。
• 它生成计算要求的大型数据集。
• 分辨率的限制,有时有结构性细节不能好看。
• 大样本研究十分困难。
• 低温电磁设备是昂贵的,需要专家用户。

相比其他结构生物学技术,如核磁共振光谱和x射线晶体学,低温EM有着独特的优势和局限性。核磁共振光谱非常适合学习小蛋白质的动态和交互的解决方案,提供原子水平结构和动力学信息。然而,核磁共振面临着限制在解决大蛋白复合物和膜蛋白。低温EM,其研究能力更大、更复杂的结构,补充NMR通过提供高分辨率结构的大分子。^6,14,27

x射线晶体学,另一方面,一直是一个突出的技术来确定原子水平结构的蛋白质。是特别有效的中小规模的蛋白质和秩序井然的水晶样品。然而,一些蛋白质是具有挑战性的结晶,其结构可以在结晶过程中扭曲。低温新兴市场提供了一个可获得结构不需要晶体的形成,使之更适用于更广泛的蛋白质复合物。^6,14,28

总之,低温EM最适合研究大型和灵活的大分子,复合物构象异构性和膜蛋白。其想象能力本国国内的样品及其兼容计算分析导致其强度。而低温EM补充核磁共振光谱和x射线晶体学,解决其局限性,每种技术都有其独特的优势,使他们有价值的结构生物学工具箱中的工具。方法的选择取决于具体的研究问题和生物分子的特点被调查。^6,14

低温EM发现应用程序在各个领域的科学研究,使洞察生物大分子的结构组织和动态。下面是一些例子的应用低温。

1. 结构生物学:低温EM已经彻底改变了结构生物学通过确定的高分辨率结构具有挑战性的目标,如膜蛋白,大大分子组件和灵活或异构复合物,无法访问,传统的结构生物学技术(图5),这促进了蛋白质结构的理解,功能、机制和交互。
   
   
   
   
   图5:低温电磁结构复杂的光收获2Marichromatium purpuratum分辨率为2.4一个。信贷:改编自嘉丁纳et al ., 2021),^29日复制下创作共用署名4.0国际4.0 (CC)许可证。
   
   
2. 病毒学:低温EM允许病毒衣壳的可视化,信封和表面蛋白,帮助疫苗研发,抗病毒药物设计和理解病毒装配、复制和感染机制。最该领域最新进展的相关峰值的结构蛋白质SARS-CoV2ο病毒(图6)。
   
   
   
   
   图6:低温EM长篇SARS-CoV2ο突起蛋白的结构。信贷:改编自你们et al ., 2022年,^30.复制下创作共用署名4.0国际4.0 (CC)许可证。
   
   
3. 细胞生物学:低温EM提供洞察细胞结构和组织通过可视化细胞细胞器、细胞骨架网络和细胞内分子复合物。它有助于解开基本细胞过程和有丝分裂一样,内吞作用,细胞内运输和细胞器生源论(图7)。
   
   
   
   
   图7:低温等应用于有丝分裂纺锤体的研究。答:层析片显示细胞在中期(ch:染色体;p:纺锤体两极)。B:三维重建所示相同的主轴,叠加相应的系列x线断层照片。信贷:改编自Kiewisz et al ., 2021年,^31日复制下创作共用署名4.0国际4.0 (CC)许可证。
   
   
4. 药物发现:低温EM起着至关重要的作用在药物发现和开发结构的阐明药物靶点,如G protein-coupled受体(GPCRs)和离子通道(图8)。这项技术有助于合理药物设计,理解和优化药物功效和特异性配体绑定机制。
   
   
   图8:低温循环nucleotide-gated EM结构的离子通道SthK。(PDB: 6 cjq)。信贷:Nimigean厘米,Rheinberge J下重现Creative Commons 0 1.0通用(CC0 1.0)公共领域奉献。
   
   
5. 神经生物学:采用低温EM研究神经元突触的结构,神经递质受体和大分子复合物神经退行性疾病(图9)。它有助于揭示突触传导的分子机制,神经信号和神经系统紊乱。
   
   
   
   
   图9:低温等主要海马神经元的突触囊泡。答:一层析的神经元突触。B:三维重建的x线断层照片显示synaptical囊泡(SV)的分布。PostMito =突触后线粒体;人口、难民和移民事务局=突触前膜;PoM =突触后膜;直流电压=致密核心小泡;EV = endosomal囊泡;太=微管;水户=线粒体。信贷:改编自·鲍尔et al ., 2017),³²复制下创作共用署名4.0国际4.0 (CC)许可证。
   
   
6. 生物化学和分子生物学:低温EM协助研究大分子组装参与至关重要的细胞过程,包括DNA复制、转录、翻译和蛋白质折叠。它提供了有价值的结构信息对理解这些生物过程的分子机制(图10)。
   
   
   
   
   图10:低温EM人类RNA聚合酶III apo结构形式。(PDB: 7 a6h)。信贷:Girbig M, Misiaszek广告,Vorlaender可,米勒连续波,复制下Creative Commons 0 1.0通用(CC0 1.0)公共领域奉献。

总之,低温新兴市场已经成为变革性技术在结构生物学领域,对我们理解复杂的大分子组装和细胞结构。通过启用的可视化生物样品在他们的母语状态和高分辨率,低温新兴市场提供了前所未有的见解不同的生物分子的结构和功能系统。它的多功能性使得研究者研究广泛的样本,从单个蛋白质和病毒完整的细胞和组织。低温EM独特的可视化能力大且灵活的复合物,经常挑战其他技术,导致了突破性的发现在药物设计和疫苗等领域发展。然而,低温电子显微镜显示了一些局限性,相关样本的异质性和大量计算资源的必要性。尽管如此,连续的硬件和软件的进步,加上混合方法,与其他结构生物学技术,结合低温EM继续扩大的范围和影响这种强大的方法。