电生理学基础，膜电位与电生理学技术

电生理学是测量生物细胞(肌肉细胞、神经元或干细胞)的电活动或“兴奋性”。这可以在单细胞水平上完成，也可以包括同时测量数百或数千个细胞。

本文着重于单细胞电生理学，通过描述动作电位的离子基础和用于探索和理解可兴奋组织和器官的不同电生理学技术，介绍了电生理学研究的基本原理。

简单地说，电生理学是研究细胞、组织、整个器官和系统内生物回路的电特性。

在最简单的层面上，任何电子电路(如收音机或计算机)都包含一个电池，电池通过铜线与组件连接，带负电的电子通过电池流动并做功，遵循欧姆定律:电压(V) =电流(I) x电阻(R)。

在生物学中，可兴奋的细胞也遵循同样的基本规律，但电荷是由溶液中的原子携带的- - - - - -也就是氯离子(Cl^-)，钠(Na⁺)，钾(K⁺)和钙(Ca^{2 +}))。这些离子的流动由离子通道调节- - - - - -催化离子沿电化学梯度被动流动的酶(如下所述)。这些离子通道是由不同基因编码的蛋白质。物理原理与电子电路相同，但生物原理增加了几层复杂性。

自从伽伐尼在18世纪末用金属电极制作青蛙腿动画以来，科学家们一直在物理学和生理学的交叉领域工作，以开拓我们对是什么使细胞“兴奋”的理解。¹

电生理学理论、技术与设备研究进展在过去的一百年里，我们对身体工作原理的理解大大增强，包括对心脏、大脑(和其他器官)的基本知识，以及对疾病诊断和治疗的改进。

早期的见解是认识到溶液中的带电离子可以移动并产生电压差，这是一种物理现象，可以用物理学家解释能斯特方程(关于历史，请参阅Archer, 1989)。然后在20世纪50年代早期，霍奇金和赫胥黎揭示了神经元动作电位的离子基础，²激发了一段时间的密集调查，以了解行为电位背后的分子机制。^3.电极设计的技术进步是并行的。⁴1981年，Sakmann和Neher发表了他们关于膜片钳电生理学的论文，率先使用了玻璃微管，能够通过单个离子通道或单个细胞膜测量离子流量。⁵这项技术推动了我们对可兴奋细胞工作方式的理解，并使科学家能够研究兴奋性和大脑功能的基本机制⁶在这个帮助下

膜电位，动作电位步骤，动作电位图

膜电位

膜电位是细胞膜上的电压或电位差。电位差是由分离电荷的疏水膜引起的，它既充当电容器，又充当电阻，阻止带电离子在膜上移动。

携带电荷的主要细胞离子是钠⁺K⁺、钙^{2 +}和Cl^-．这些离子在细胞内外有不同的浓度。所以当离子通道打开时，离子想要移动以平衡它们的浓度。

一般来说,Na⁺、钙^{2 +}和Cl^-离子存在于较大浓度的细胞外和K⁺离子:细胞内浓度较高的离子，细胞内部带净负电荷这就建立了一个电化学梯度(或“驱动力”)，当离子通道打开时，可渗透离子沿着电化学梯度流动，带着电荷穿过膜，引起电压变化。这导致细胞膜电位的去极化或超极化。

带正电的离子Na⁺和Ca^{2 +}有一个电化学梯度有利于它们进入带负电荷的细胞，所以它们带正电荷去偏光电化学势。另一方面，K⁺离子在细胞内高度集中，所以它们的驱动力是相反的方向，即细胞外。结果，它们把正电荷带出细胞，使细胞膜电位更负;这叫做超极化．

离子不能自由扩散通过疏水脂双分子层细胞膜，但它们可以通过通道或孔隙设置在它里面，从里面延伸到外面。其中许多通道仅对一种离子具有高度选择性，并且通常是“门控”的，仅在膜电压变化(电压门控离子通道)或小分子或配体结合(配体门控离子通道)时打开。

离子在膜上的流动决定了膜的总电阻(根据欧姆定律)。如果有大量的通道打开，膜电阻(Rm)会很低，因为打开的通道越多，可以流动的离子越多，从而产生更大的电导和更小的电阻。

脂质双分子层的另一个重要特性是其电容(膜电容，Cm)，这源于双分子层的物理特性;浸没在两侧导电溶液中的绝缘体。膜上的电荷分离与膜上的电位差有关。净效应是，在改变膜电位之前，通过离子通道的离子流必须先给膜电容器充电。因此，电容大、电导小的电池电位变化缓慢，而电容小的电池电位变化快。这种变化的速度通常被称为膜时间常数，Rm。Cm = Tau．神经元的这一特性对突触电位累积的时间间隔有深远的影响(见下面关于梯度电位的部分)。

动作电位步骤和图表

可兴奋细胞通常具有-60 mV左右的静息膜电位(相对于细胞外部测量时，内部为负值)。骨骼肌、心肌和神经元表达电压门控钠⁺通道和电压门控K⁺频道。

在动作电位中，电压门控Na⁺通道打开，钠离子迅速流入⁺离子和细胞膜电位的快速去极化。如果这就是全部的过程，那么电势就会到~+ 40mv并保持在那里。但是，这种强去极化打开了电压门控K⁺K通过的通道⁺离子流向相反的方向，并将电压拉回(再极化)到-60 mV左右。动作电位的具体持续时间和波形由可兴奋细胞膜中存在的离子通道的类型和密度决定，分别如图1和图2中神经元和心脏细胞所示。

图1: 神经元动作电位。

神经元

1)动作电位必须由静息膜电位的小去极化(约-60 mV)触发;例如，这可能是由突触输入引起的。当去极化达到“阈值”时，这会触发电压门控钠的打开⁺通道(-55 mV)。2)这导致了Na的快速流入⁺离子使膜向+40 mV去极化。3)娜⁺通道失活(一种闭合形式)在一毫秒左右，电压门控K⁺通道开放。4) K的外流⁺离子再极化膜回到-60 mV或更多的负电位，造成后超极化电位。5)在一个慢得多的时间尺度上，通过膜交换的极微量离子被膜结合的钠泵回⁺/ K⁺交换器(有时称为离子泵)，交换K⁺和钠⁺离子重置和维持静息电位。

图2: 心脏动作电位。

心肌细胞

1)快速钠⁺通过电压门控钠流入⁺通道使细胞膜去极化。2)电压门控K⁺频道打开，开始复极化。3)电压门控Ca^{2 +}通道打开，钙离子流入^{2 +}正电荷被K的流出平衡⁺带正电荷，产生平台期。4) Ca^{2 +}通道关闭，K⁺通道保持开放，复极化膜电位为- 90mv。

当细胞膜去极化到钠的阈值时，动作电位就会启动⁺通道激活。在神经元中，动作电位是神经元交流的基础。

梯度电位是膜电位在阈值以下的变化，以响应刺激或来自其他细胞的神经支配。这些突触后电位可以是兴奋性的(去极化)或抑制性的(超极化)，这取决于它们所处通道的类型。亚阈值响应对动作电位启动的影响由许多因素决定，包括:输入的大小及其后续响应，距离动作电位启动部位的距离，以及膜的生物物理特性，如膜时间常数τ．在实践中，分级电位在一个称为次阈值积分的过程中相互叠加。(图3)。

图3: 分级的潜力。

电生理学家测量pA级的小细胞电流- - - - - -nA。因此，它们需要能够排除周围环境振动和电气干扰(噪音)的敏感设备。所需的标准钻机设置在体外而且在活的有机体内电生理学如图所示(图4)。

图4: 标准电生理学装置设置。

1)空气表，防止物理振动，增加运动伪影的实验记录。

2)法拉第笼，屏蔽装置免受电干扰。去除环境电噪声对于获得清晰、有用的电生理记录至关重要。

3)显微镜和微操作器(s)定位微电极。根据实验装置的不同，用户可以结合多光子成像功能。为在活的有机体内在检查时，使用者可能会选择移除显微镜，为其他设备腾出空间，如跑步机。

4)一个放大器用来收集和放大你电极上的信号。它连接到一个数字转换器，将模拟信号转换成数字信号。

5)需要数据采集和分析软件来建立实验，设计和运行协议，并从收集的数据中提取有意义的结果。

此外，用户可能需要考虑结合药物输送系统和温度控制装置。

膜片箝

膜片钳电生理学是Sakmann和Neher在上世纪七八十年代首创的一项技术⁵为此他们分享了1991年获诺贝尔生理学和医学奖．它涉及到在不刺穿细胞壁的情况下，用一个细胞或一小片细胞膜建立一个串联电路。取而代之的是，一个充满离子溶液的玻璃微移管，并含有一根银/氯化银线，连接到膜片钳放大器，在膜片和玻璃之间形成一个高电阻千兆赫的密封。膜片钳的不同配置:cell-attached，全细胞，由内向外而且外部；如图5所示，图5是根据原论文改编的。⁵该图强调了用于进行全细胞的关键路径在体外膜片箝记录。

全细胞结构是通过用微细玻璃微电极接近细胞膜来实现的，该微电极经过微锻造加热和拉伸，使口直径为~1µm，电阻在2到6 MΩ之间，并且移液器偏移置零．

在微移管中注入内部溶液，并在微移管接触细胞膜时施加正压(< 2ml)，即可观察到酒窝。通过命令5 mV步进脉冲到电极，我们可以将其作为密封测试，以了解何时与电池进行贴片密封。释放正压使膜和移液管口相连，形成一个松散的贴片，增加电阻，降低在5 mV密封测试中观察到的电流幅值。光吸将一“片”膜推进移液器的口部，这就是所谓的移液器cell-attached配置并在毛细管玻璃和膜贴片之间产生高阻(GΩ)密封。这通常将观察到的密封测试电流降低到在电压阶跃的开始和结束处具有两个快速移液管电容瞬态的平坦线。这些被膜片钳放大器中的电路除去。

走之前"全细胞时，电极被轻轻拉出并向上拉至表面边缘消除了细胞核阻塞贴片的风险，增加了接触贴片的机会阻力。电池保持在大约等于静息膜电位(-60 mV)的负电位，并施加负压使膜破裂。破裂意味着移液管溶液现在与细胞质连续，整个细胞的电学性质与移液管电极串联在一起。这意味着整个细胞膜的兴奋性现在可以被测量和控制。

图5: 如何实现不同的膜片钳配置。

在全电池配置中，可以在电流箝位和电压箝位模式下研究电池的电学特性。

Current-clamp

在电流钳模式下，用户通过设置向细胞内部注入已知的电流幅度，并观察细胞对这些电流注入的兴奋性变化。这是一项有价值的技术，因为它可以模拟生理场景，比如突触输入。在图6 A中，你可以看到一个单元对10 pA步骤中从- 20pa增加到+ 20pa的阶跃电流注入的响应，这样+ 10pa的电流注入足以使单元达到阈值和火灾动作电位。⁷图6 b显示了多个细胞的平均电流注入-放电速率关系的总结图。电流注入与细胞的放电速率之间存在正相关关系。

图6: 小鼠脑切片制备中AgRP神经元的电流钳研究。图源:Branco et al. 2016，⁷转载于国际知识共享归因4.0许可证。

电压钳位

在电压箝位模式下，膜电位在用户指定的电压下被箝位。该钳由反馈放大器和前置级使能，注入电流以保持电池的膜电位在不同的命令电压由用户设置。

离子通道在不同的命令电压下打开，这意味着当离子电流流过膜时，膜电阻会发生变化。反馈放大器瞬间通过注入倒数电流来补偿这一点，以保持电池在命令电压，给出这个注入电流的读出作为膜电流。

虽然它不是细胞离子特性的生理测量，但它已被证明是一种非常有见地的方法，用于研究存在于细胞膜中的电导和那些构成细胞兴奋性的电导。²当与不同电导的药物阻滞剂联合使用时尤其有用。在图7中，在Na存在的情况下，用电压钳研究了小鼠听脑干梯形体内侧核(MNTB)和橄榄外侧上核(LSO)的神经元⁺通道阻滞剂来隔离K⁺电导。⁸这个实验的目的是研究一个这样的电压门控K的相对贡献⁺通道(K_V3.1)到总K⁺通过记录在不同电压阶跃命令下的电流，在有无已知的K阻滞剂的情况下进行电导_V3.1 K⁺，四乙胺(TEA)。从图中可以看出，TEA降低了峰值向外K的整体振幅⁺MNTB和LSO神经元在+40 mV时电流降低~ 50%。这表明K_V3.1通道介导细胞向外K的50%⁺电导。

图7: 电流-电压关系 K⁺ 听觉脑干细胞中测量的电流。从MNTB (A)和LSO (B)中观察到的电流痕迹。从MNTB (C)和LSO (D)中观察到的电流-电压关系(IV曲线)显示了在每个命令电压下记录的峰值和持续电流的幅度。电压命令步长见于(C)。在MNTB (E)和LSO (F)中观察到TEA (1 mM)不存在和存在时的峰值电流。来源:Choudhury et al. 2020，转载于创作共用属性4.0国际许可．

这项技术包括将电线电极或硅探针直接放入被试体内在活的有机体内或将原代细胞、培养细胞或组织切片在电极上分层体外。

为体内细胞外在电生理学上，电极的直径通常很薄，并向下滑动到邻近感兴趣细胞的组织中。这种技术的优点超过细胞内的电生理学的优势在于，它可以在清醒的、有行为的受试者身上进行，从而更深入地了解行为背后的神经元活动。电极的排列方式为:

• 单电极——一个电极，一个记录点
• 四极-四个电极捆绑在一起，使更好的电池分类
• 多电极阵列(MEAs) -多个记录电极阵列，记录跨更大区域的组织

电极记录下由神经元放电产生的电场电位。这些波形被称为“局部场势”，可以由邻近电极的多个单元的峰值组成。电极或硅探针可以“监听”的神经元数量取决于电极的阻抗和可用的记录位点(通道)的数量。

单机记录

研究人员在表演时必须仔细准备他们的实验对象在活的有机体内电生理学实验(图8)。脑组织的记录需要移除一部分颅骨才能进入大脑。电极必须以每秒1µm的速度缓慢地通过组织，以防止机械应力并避免在组织中引起出血。使用微操作器有助于这一点。当电极接触大脑表面时，实验人员通过“归零”他们的微操作器坐标来知道他们在大脑中的位置。然后，他们可以将自己的位置与公布的大脑图谱坐标进行比较，例如艾伦脑图集．一旦进入他们感兴趣的区域，实验人员就可以通过微驱动器移动探针或电极，以提高感兴趣神经元的记录保真度。

来自电极的信号被放大，并使用示波器实时观察。实验者还通过连接一个音频设备来“听”细胞峰值活动，该设备对峰值响应输出噪声。⁹在感兴趣的细胞类型中表达通道视紫红质的转基因动物实验对象的实验人员也可以结合使用在活的有机体内电生理学光遗传刺激，使用光源照射他们感兴趣的神经元。^9，10

Spike排序算法和软件使用户能够将局部场电位分类为单个单元或神经元，以便在记录后进行分析。¹¹这一步是至关重要的，因为期间记录的数据在活的有机体内录音可能会非常嘈杂。

图8: 在活的有机体内电生理记录建立。微电极通过微操作器放入组织中。一旦微电极处于正确的区域，微驱动器就可以实现微电极的精确定位。操作者使用显微镜对电极进行正确的引导和跟踪。来自组织的信号由放大器放大，并在示波器上跟踪活动。计算机可以通过数字接口和放大器对实验进行记录、监测、分析和控制。

多部件记录

最近,技术的进步在电极设计上的改进导致了Neuopixels探针的发展。¹²这些探针使用互补金属氧化物半导体(CMOS)技术，能够同时记录数千个神经元。¹³随着技术的不断进步，这个数字似乎还会增加。

Neuropixels的优点是沿着电极柄的许多记录位点提供了前所未有的分辨率。然而，这种方法的缺点是，当信息投射到脑组织时，只能从与单轴相邻的神经元中收集信息。这在一定程度上可以通过在每个录音会话的不同位置组合多个电极来克服。但是，在大脑中植入电极的数量是有实际限制的。

像cmos托管的解决方案在活的有机体内多电极系统(CHIME)能够记录数百个分散在3D排列中的电极。电极由数百个玻璃外壳的微电极组成，这些微电极从CMOS放大器阵列投射下来。¹⁴这些能够在更大的空间区域监测神经元活动。

多电极阵列(MEA)

在一个盘子里的多个电极阵列可用于更高的吞吐量细胞外细胞层的记录在体外或者大脑切片。MEA系统已经在临床前和药物发现研究中使用了50多年。¹⁵

电极像棋盘一样排列在盘子的底部。然后在它们上面培养细胞，或者将组织切片放在上面。细胞活性是在细胞外用局部场电位来测量的。通过同时记录多个电极，研究人员可以研究组织内或细胞间的网络动态，以及同时从多个细胞收集数据，增加了这些实验的吞吐量。

在MEA设计方面，随着CMOS阵列等新技术的出现，近年来每口井的电极数量有所增加。这意味着每个盘子的电极数量从64个跃升到1000多个，提高了科学家观察和记录细胞活动的分辨率。

电生理学的调查:	细胞内的	细胞外
记录级别:	研究单个细胞	同时从多个单元进行记录
准备:	可以在活的有机体内或在体外	可以在活的有机体内或在体外
可能的配置:	全细胞，细胞附着，松散贴片，单通道，穿孔修补由内而外和由外而外的结构	MEA，心脏电生理学，高通量，自动化电生理学
吞吐量:	中至低	高
实验能力:	电压钳，电流钳和可动态夹紧	通常只有电流钳配置是可能的。虽然可以配合电或光遗传刺激

临床前研究

这两个在体外而且在活的有机体内电生理学广泛应用于临床前和学术研究。这些技术的使用极大地促进了我们对行为神经科学、连接组学、神经生理学和神经药理学、心脏病学和毒理学的理解。此外，当测量神经元活动时，电生理学仍然是“基本事实”。¹⁶

药物发现

中高通量电生理系统用于细胞中的化合物筛选或毒理学分析。一些系统可以自动“贴片”细胞，而另一些则使用电极阵列来测量细胞的局部场势。根据应用，高通量电生理系统可用于测量细胞收缩，阻抗和其他测定。¹⁷

临床电生理学

临床电生理学家定期对患者进行测试，以协助医疗诊断和患者监测。这些测试包括12导联心电图(ECG)、脑电图(EEG)神经传导测试和听觉测试。¹⁸

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关于作者

亚当·托泽博士

亚当在福赛斯实验室接受了研究生培训，他的研究重点是大脑中处理听觉环境的重要区域中神经元之间的通信。随后，他分别前往英国剑桥大学的海斯勒实验室和布兰科实验室，以及英国剑桥大学的分子生物学MRC实验室。他的博士后研究主要集中在下丘脑的神经元通信，特别是驱动进食行为的神经元。亚当是一个狂热的科学传播者，他从实验室转到全职的科学传播和营销，帮助推广世界各地实验室所做的伟大工作。

伊恩·福赛斯教授