药物发现的高通量筛选方法

药物开发是一个漫长而昂贵的过程。一个研究报告于美国医学协会杂志研究发现，在2009年至2018年期间，一种药物的平均投资需要一路走到最后发展管道因此，它可能会被考虑进行监管批准是13亿美元。巨额支出的一个原因是药物失败率高。研究发表在自然生物技术2003年至2011年间，90%进入临床试验的药物未能获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准。多年来，制药行业一直在经历研发生产力的下降，这反过来又加剧了未满足的临床需求。在本文中，我们将讨论如何使用不同的高通量筛选(HTS)方法来帮助加速药物发现过程。

由于可供筛选的化合物数量众多，制药公司一直在采用HTS方法，这种方法可以快速而廉价地筛选其化学文库，以确定对特定生物靶标具有活性的最有希望的化合物。高温超导通常涉及到的使用自动化(如液体处理机器人);小型化如1536孔板格式与大规模数据分析等的结合人工智能。

“几十年来，HTS一直是药物发现行业的主要内容。它允许在非常专门定制的生化分析中自动分析药物活性。然而，到目前为止，这些特意设计的检测方法的读数仅限于非常少量的靶标。叶朝阳博士他为HTS开发了一种具有成本效益的RNA测序方案。

在下面的章节中，将重点介绍使用新开发的HTS平台来支持药物发现。

通过成像读出荧光

基于荧光的测定是一种方便的方法，可以在高通量环境中可视化对特定化合物的生物反应。根据荧光强度，还可以确定生物活性的程度。荧光测定可以设计成在产生或消除靶分子时发出或熄灭信号。最近,塞西莉亚Eydoux他是该研究所的一名研究工程师AFMB实验室和同事创建基于荧光的HTS检测严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV) RNA合成复合物。这个复合体是由非结构蛋白(nsp)-7、nsp8和nsp12的一种蛋白质序列，由于它与SARS-CoV-2高度同源，因此它有可能被用作设计蛋白质合成抑制剂的手段。利用已知的蛋白质相互作用，研究小组创建了一种检测方法，当nsp-7/8与nsp-12(一种RNA依赖的RNA聚合酶)结合时，荧光染料会插入双链RNA以产生荧光信号。

研究人员通过筛选来自Prestwick化学库的1520种fda批准的化合物来验证他们的分析方法^®。选择该化合物文库是因为其具有较高的化学和药理多样性以及已知的人体生物利用度和安全性。筛选是在自动液体处理机器人和荧光读出仪的帮助下进行的。基于30%抑制的临界值，计算出的命中率为3%，候选药物属于蒽环类药物和四环类药物家族。

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质谱分析

化学发光和荧光读数的局限性在于它是生物活性的间接测量。Andreas Luippold博士等等，最近发达使用HTS方法质谱分析。作者认为，质谱是一种无标签技术，提供了直接的底物到产物转化的证据，这对药物发现更具有生理学意义。这个方法还有风险降低可导致假阳性和假阴性的复合干扰，它不需要定制的信号介质来放大信号，如荧光读出。然而，到目前为止，将质谱与液体处理机器人相结合一直是一个挑战，质谱中使用的缓冲液也可能是一个挑战不兼容的保持蛋白质的酶活性。

Luippold及其同事配置了基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)设备，并为其配备了液体处理机器人，使其与1536孔板(或4 × 384孔板)兼容。这使得样品从检测板和基质溶液转移到MALDI靶板上具有稳健性和可重复性，使他们能够筛选约4900个针对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的抑制剂库，这是一种已知的治疗靶点糖尿病和肥胖。作者还对他们的方法与生化分析和自动斑点技术进行了头对头比较。生成100万个数据点(即筛选100万个化合物/分子片段)，MALDI-TOF HTS方法只需要5.1天，而生化分析需要11天，自动斑点技术需要7天。

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电池系统

影响中枢神经系统的疾病呈上升趋势，但是故障率高由于它们不能通过血脑屏障(BBB)，在中枢神经系统候选药物中仍然存在。中枢神经系统药物的成功率为只有7%这大概需要10.5年开发这一领域的治疗方法，这比其他疾病要长得多。Elisa Moya博士阿图瓦大学(University of Artois)研究员阿图瓦大学(University of Artois)及其同事最近说发达一个小型在体外在进行昂贵的临床前研究之前，建立血脑屏障模型，研究药物毒性和血脑屏障渗透率对早期药物发现的影响。

Moya强调了HTS在这种情况下的一些优势:“在BBB在体外在临床前研究阶段，HTS的发展至关重要，原因有很多。例如，它使研究人员能够快速评估大量药物/化合物，并且更好地适应早期药物发现对中枢神经系统化合物发现所需的高产量。”她还指出，他们的方法减少了材料和塑料的浪费，使研究人员能够及早筛选出薄弱的候选材料，从而减少了需要使用的进一步测试的数量在活的有机体内模型。

"基于一个有专利的成熟人类在体外阿图瓦大学创建的BBB模型，我们开发了一个小型化和自动化的复制。重复作业采用96井系统格式，并结合自动化技术。”

该团队创造了人类BBB在体外使用从人脐带血中分离的CD34+造血干细胞衍生的内皮细胞建立模型，并将不同数量的细胞植入有孔插入的96孔板。周细胞，血脑屏障的主要细胞类型，也被播种在孔板的底部。然后，作者通过分析荧光细胞旁标记物荧光素钠通过内皮细胞层的运输来评估血脑屏障的完整性。当Moya和同事比较人工和机器人制造的BBB完整性时，它们在不同的井板格式下具有可比性，这表明形成了紧密的包裹网络。共聚焦成像也证实了机器人播散的血脑屏障中存在粘附连接蛋白(如钙粘蛋白)和紧密连接蛋白(如claudin-5)。

接下来，研究小组筛选了一组药物，如安非他酮谁的脑/血浆游离/非结合比例值是已知的在活的有机体内。结果表明，使用小型化血脑屏障模型测试的各药物的游离/非结合分数比与血脑屏障模型相似在活的有机体内数据与人类有很强的相关性(R²= 0.8808)。当Moya等人测试其微型模型的血脑屏障完整性时，他们还发现神经毒性药物如鱼藤酮极大地破坏了血脑屏障，而血脑屏障的完整性不受非神经毒性化合物如对乙酰氨基酚的影响，进一步加强了他们的模型的生理相关性。

“我们已经证明了这一点在体外BBB模型能够获得预测结果，并且适用于药物化合物的HTS，”Moya补充说。虽然他们的模型的效用已经被证明，但重要的是要注意一些关键的局限性，包括只包含两种细胞类型和缺乏动态流动环境。

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RNA序列

RNA测序是了解药物作用的有力方法。这种方法使用RNA转录组作为代理，但目前可用的技术通常是低通量、昂贵和人力密集型的。叶朝阳博士及其同事为HTS开发了一种具有成本效益的RNA测序方案DRUGseq通过放弃冗长的RNA纯化步骤和采用多路复用策略。药物治疗后，细胞被裂解，mrna被直接逆转录(RT)。该团队还在RT引物中引入了特定的条形码，使他们能够从单个井中收集cdna，减少了多井处理所需的劳动力。

为了进一步减少所需的时间和成本，Ye及其同事还测试了减少读取深度对药物治疗后检测到的基因数量和捕获差异表达基因的准确性的影响。与传统的4200万reads/well相比，DRUGseq文库的测序量分别为200万和1300万reads/well，即使在较浅的读取深度，基因表达在井间也是一致的。

接下来，该团队应用DRUGseq筛选了一个包含433种已知靶标化合物的文库。通过DRUGseq检测到的差异表达基因的数量与来自连接图尽管使用了不同的技术平台，但由于药物治疗导致的细胞扰动的大型数据集。

最后，作者使用DRUGseq比较了CRISPR敲除和一种经过验证的化合物环己亚胺对RPL6的抑制作用。他们发现，虽然CRISPR治疗降低了RPL6mRNA，环己亚胺则没有。然而，与DMSO处理和非靶向对照样本相比，两种处理的转录组谱在机制上更加相似，并且聚集在一起。作者最后强调了DRUGseq相对于竞争平台的优势PLATE-seq它们具有较低的吞吐量和计算偏差。

“这项工作可以经济有效地在数百到数千个井中对数千个基因进行转录分析，并且与工业环境中现有的化合物筛选自动化兼容。挑战在于，它需要在筛选自动化方面进行前期投资，以实现真正的成本效益。通过测试各种反应条件也可以提高转录本捕获效率，这将提高检测灵敏度，降低每口井的测序成本。”

他继续说道:“我们希望未来有更多的实验室采用并改进这项技术。作为原研究的延续，最近手稿已提交给bioRxiv我的同事对这个平台进行了更严格的测试，并向公众提供了分析工作流程。”

结论

药物发现成功率的持续下降将导致临床需求得不到满足，制药公司寻求收回其研发投资，从而导致药品价格上涨。HTS是一种快速高效地筛选大量复合库的策略。传统的方法，如荧光读数和细胞培养模型可以与自动成像系统、液体处理机器人和小型化集成，但往往依赖于生物活性的间接测量，而质谱仪可以集成到HTS工作流程中，以促进分子片段和活性的直接测量。最后，随着测序技术的快速发展，具有HTS能力的RNA测序有望成为利用CRISPR基因编辑进行新型化合物机制研究、化合物再利用和基因转录网络鉴定的有力工具。