宿主细胞蛋白质分析生物制药

学校:生物制药的不可避免的杂质

狮子的份额biotherapeutics今天是DNA重组技术的一种水果。在生物制药产品,表达的蛋白质药物在高浓度精心挑选和设计宿主细胞系统,如哺乳动物细胞(CHO),大肠杆菌、酵母或植物细胞。

产品然后进行复杂的净化步骤删除所有细胞主机系统的组件。然而,大量的其他蛋白质表达的宿主细胞在生产过程中很容易污染药物,在净化过程中被甩在后面,使宿主细胞蛋白(学校)剩余流程相关杂质。

HCP污染物的最终产品,即使在非常低的水平(1 - 100 ppm),可能引起不可预知的和严重的免疫原性反应在人类身上。准确的检测、识别和量化的学校在biotherapeutic发展从而确保患者安全的关键,并监管要求。遵守这样的规定,应用先进的净化和分析方法是必须的。

HCP分析的重要性和挑战

学校在生物制品被认为是一个关键质量属性(CQA),¹从而使产品基准的间隙来演示一个健壮的生物过程。

这个专业群process-derived杂质构成复杂的混合物和各种生化的免疫学特征。HCP药物产品威胁患者的安全性和有效性。产品在三个主要方面:

)学校是免疫原性,即使在最小的浓度是外国对人体。

b)学校与蛋白水解活性造成分裂的蛋白质产品,大大降低产品产量、稳定性和有效性,如果没有充分去除或灭活。

c)的学校形成可溶性或不溶性聚合物的聚合各种大小的一个潜在的问题是总量可能导致不良反应管理和作为佐剂,加剧了免疫反应的药物产品。²

根据安妮De Groot教授罗德岛大学免疫学和信息学研究所,相关的独特挑战HCP间隙:

)的异质性和复杂性的学校作为杂质,这使它有别于其他单一分析物杂质。虽然有可能数以千计的蛋白质需要监控,目前尚不清楚有多少这些蛋白质表达和哪些co-purify和产品不同的物理性质,如分子量,等电点和疏水性,可以接受不同的转录后修饰,如糖基化、磷酸化和截断。³

b) Co-purification HCP产品由相似的生化属性或HCP和产品的直接交互。这种“搭便车”的倾向的学校是特定产品和/或过程。学校与蛋白质产品co-purifying捕获步骤的蛋白质色谱通常范围从200 ppm到3000 ppm,但已报告值高达70000 ppm。⁴其他HCP之间的相互作用和药物产品尚未完全特征。化验必须能够广泛撒网抽样,成千上万的分析物同时基于HCP的人口开始进入净化阶段。

监管指引

毫无原则,指定具体的容许极限HCP的产品。方法开发专家博士Keshavamurthy普拉卡什在跨国生物制药公司,解释说,设定一个行业数值阈值是具有挑战性的,如果不是不可能的话,目前的分析技术和考虑到复杂的和可变的杂质以及化验。

通常,生物技术产品预计包含少于100 ng HCP /毫克的产品。卫生当局评估可接受HCP水平在个案基础上,和基本的决定因素,如临床发展的阶段,患者人群,给药途径、剂量和作用方式的产品。使用风险评估了设置HCP限制每个产品是至关重要的。⁴

部分Q6B规格(生物技术产品)和Q11(药物的物质)的开发和生产国际协调会议的指导方针 ⁵解决地理过程相关杂质,指定HCP杂质必须监控和减少到可以接受的水平,确保产品质量和病人安全。这两个我们 ⁶和欧洲药典 ⁷发表了通用章节列出的最佳实践的发展和验证HCP化验。的食品及药物管理局 ⁸预计复苏和引入的污染物净化过程是低于检测水平使用高灵敏度的分析方法,尽可能。欧洲药品局(EMA)指导CPMP BWP / 382/97 ⁹总结了残余HCP必须经常使用合适的分析化验,检测和监控,这样的结果是一致的,满足规范的限制。其他国家的监管机构自己的条款HCP控制,但它是一个敏感的公认,验证方法是需要监控剩余的学校按照我的指导方针。

分析技术

选择适当的方法识别和量化HCP一直关注在流程开发和制造。在整个生物技术产业,immunospecific化验如ELISA、免疫印迹等非特异性方法1 d和2 d电泳二维色谱和这种动物了HCP女士监控。最近,评价表面等离子体共振(SPR)技术提供了一个更敏感,效率和简化HCP分析的过程。¹⁰

虽然开始的学校往往是人口相对一致的产品相同的平台产生的细胞培养过程中,这些蛋白质的组成和数量在净化过程的每一步都可能有很大的不同。化验报告的价值,代表总HCP内容,高度试剂(如抗体制备)和方法(ELISA与MS)具体。此外,从实验室,实验室检测标准不同,相同的样本测试不同的化验/实验室可能会产生不同的HCP值。

Immunospecific方法

ELISA

由于其方便、速度和灵敏度anti-HCP酶联免疫吸附试验(ELISA)被认为是黄金标准分析的学校。¹多克隆抗体的开发分析提出对宿主细胞和提供了一个相对较高的吞吐量和敏感的量化。HCP-ELISA可能需要几个月的时间开发和通常能够检测绝大多数的学校,特别是高度丰富或高免疫原性的蛋白质。然而,“绝大多数”并不足以保证最终产品的安全,未被发现的免疫原性蛋白可以引起严重的反应。

西方墨点法

免疫印迹分析使用生成的多克隆抗体混合物HCP检测ELISA可以展示丰富的学校在不同的下游工序池也可以突出样本之间的差异。特色空间的西方的屁股也很有用的进一步描述在样本学校HCP-ELISA表明学校存在。西方的屁股可以用于指示是否一个HCP存在于伟大的丰富或10的学校出现在低丰度。¹¹

这些过程具体分析,而广泛使用,需要先验知识关于HCP污染物的性质,是费时和昂贵的开发。因此他们很难适应完全评估生物制药产品从不同的细胞类型和净化方案。¹²

正交方法

正交检测和监测技术,如质/ MS和2 d-dige已经成为受欢迎的补充ELISA方法。这些非特异性方法使完整的检测和表征的学校生物制剂,并可能给每个蛋白质标识信息直接从获得的数据,而不是简单地HCP的总额,这是当前基于ELISA方法的局限性。

钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(SDS检测页面)基于方法用于评估HCP杂质非常简单和快速的。SDS页面凝胶可以重载与10 - 50µg产品总蛋白染色,结合敏感,如SyproRuby、银染色,或其他类似的技术。这个强大的正交方法可以检测到的学校不HCP ELISA反应,虽然灵敏度有限~ 100 ng /每个HCP杂质/毫克的产品。¹尽管如此,这是一个相对简单的检查最后净化池,确保净化过程是按预期执行。此外,1 d SDS页面是兼容与MS技术HCP表征是非常强大的。

在一个2 d-polyacrylamide凝胶电泳(2 d-page)分析,复杂的蛋白质混合物分离根据其理化性质、染色和可视化。然而,量化的学校2 d-page由其狭窄的动态范围是有限的。Low-abundance学校不能被探测到,重组蛋白的存在往往掩盖了可见性,因此,妥协的检测能力的学校。¹²此外,学校拥有物理性质的马伯不能轻易2 d-gel分离,甚至在案件中的主要杂质时最终药物物质当量化与质谱分析。⁴

二维差异凝胶电泳(2 d消化)延长2 d-gel电泳可以解决多个样本在同一使用光谱可溶解的凝胶,大小和charge-matched荧光染料。样品多路复用的能力和内部标准提供的包含2 d-dige增强准确性蛋白量化比较分析。然而,这些方法只是半定量,动态范围有限(两到三个数量级),需要额外的技术(例如,质谱)HCP识别。³

质谱(MS)成为全球领先的蛋白质组学分析技术检测和量化low-abundance学校高的重组产品的信心。^13、14、15串联质谱分析(MS / MS)通常是结合液相色谱(LC)快速监测和识别多个蛋白质高通量的方式分析物。免疫原性和有问题的学校也可以有针对性的在高纯度样品一旦女士协议设置。¹¹因此,许多以前被忽视的学校在商业生物产品可能会认为这种技术继续得到改善。¹⁶尽管如此,但是运营所需的高技能人员/女士。设备是昂贵的,和个人的绝对量化的学校需要使用成本和劳动密集型的合成肽。随后肽验证工作也仍然是一个挑战。¹⁷

未来的视角

开发一个完整的HCP杂质的整个过程和实现一个健壮的HCP删除策略,使用多维HCP分析势在必行。女士继续进化的新功能,更直观的软件,和易用性,预计HCP分析中扮演越来越重要的角色。是通过这些技术获得的数据量的增加,测量和监控的能力成千上万的生长的蛋白质。

HCP分析涉及的未来发展,改进风险管理和评估方法通过利用信息来确定关键的学校和多个风险因素的累积知识。¹⁸web工具,使用这种数据库从CHO-based预测HCP的免疫原性产品也正在开发中。¹⁹这将是有趣的,看看这些工具可以用于个人的治疗计划,特别是如果在治疗一些学校的存在,具有良好的临床安全性,可以调查。

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