提高细胞通过基因编辑
从研发到生物制造
基因编辑技术的出现产生了更多的兴奋在生物学和医学比发现自从三十年前聚合酶链反应。通过允许几乎所有基因的删除或添加到任何细胞,基因编辑绕过了乏味的,冗长的细胞系为研究和生物制造的发展。
互联网搜索产生广泛的材料三大编辑方法:定期聚集空间短回文的重复序列(CRISPR)转录Activator-Like效应核酸酶(取得),和锌指核酸酶(ZFN)。ZFN发现第一,其次是取得,然后CRISPR。每个方法被誉为一个比其前任在易用性和低成本方面,,CRISPR几乎超越了其他技术在销售和使用所有的应用程序,但基因疗法。
传统的细胞系开发依赖于随机转基因整合到细胞染色体发生在频率的不到百分之一。“转基因整合创造了不确定性的随机性质实验结果,精确复制的遗传分子事件不可能的,”解释了玛莎车,博士,MilliporeSigma基因编辑和小说形式主管。“目标核酸酶如ZFNs取得,CRISPR生产转基因集成针对10到百分之八十的利率,一棵橡树高于随机整合。因此,基因组编辑允许复制的基因变化发表的独立科学家,创造更多的确定性观察到的基因型和表型之间的关系。
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吉拉德·兰德斯——销售和市场副总裁
”由于其简单性和可访问性CRISPR民主化基因组编辑。然而,更成熟的方法ZFN和取得更理想的关键研究,明确知识产权是可取的。”
车是专为基因治疗,取得的额外努力,涉及使用或ZFN很小而最终产品的价值。
MilliporeSigma最近改善CRISPR Proxy-CRISPR,使编辑工具更有效率,灵活的和具体的,据该公司。Proxy-CRISPR编辑依赖于两个CRISPR绑定事件,从而减少发病率脱靶切割通常发生在目标细胞的基因组序列中存在倍数。Proxy-CRISPR还允许更大的多样性选择DNA的目标。
并不是所有的细胞类型适用于基因组编辑。限制因素是细胞生长和存活的能力足够的代分离克隆。“早在基因编辑的应用研究细胞培养研究人员使用转换(癌症)的细胞类型,如HCT116、K562,因为这些细胞增长强劲的文化和编辑率高,”Rook说188金宝搏备用。“干细胞已成为越来越受欢迎由于其良好的清洁(二倍体)核型,提高编辑/文化协议,和潜力巨大的多样化的生物研究由于分化能力。”
干细胞的起源
细胞培养为纯粹的研究采取了多种形式。认识到困难的收获,培养和测试主要细胞从人类组织,多年来,科学家们使用转换(如癌症)细胞系。这样的细胞会分裂几十年来在合适的条件下,健康的主要细胞成为几代后凋亡,因此他们的行为缺乏一致性。不幸的是,癌症细胞的基因组不稳定,和细胞模型不一致对大多数生理反应药物或毒素。因此对干细胞编辑,尤其是诱导多能干细胞(万能)。通用技术允许所需的基因插入iPSC细胞,扩大细胞,分化成任何类型的细胞。
Axol生物科学(英国剑桥)专门从事基因编辑万能干细胞生成健壮的、可靠的基础和制药研究神经元。公司创始人施一尘,博士在剑桥学习古尔研究所,约翰爵士命名的古尔发现者之一的万能和2012联合诺贝尔奖得主。Axol与地平线发现另一家位于剑桥,创建由万能干细胞疾病模型。
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根据施他iPSC-based技术更相关工业和科学有效的重新编程细胞收获与疾病问题,从个人变异基因的人已经存在。
收集大量的细胞这样的病人是很困难的,尤其是在商业规模。“定义基因改造引入iPSC线与CRISPR容易得多,”史解释道。例如,它允许科学家引入特定的基因而不是接受大自然的版本的基因缺陷。
史描述样本的收集大量的挑战这样的病人,尤其是对商业研究。“这是更容易引入定义遗传修改工具像CRISPR iPSC线。”这种方法使高度控制疾病相关基因的研究,并允许细胞表型差异的研究相同的遗传背景,除了特定的基因编辑。
CRISPR-based基因插入还提供了一个修改的手段不可能收获从活体供体细胞,如皮质神经元,以反映细微复杂的疾病,如阿尔茨海默氏症。这些文化已经成为无价的组装板细胞检测培养细胞的药物发现。
施强烈认为,干细胞,不是体细胞的起点创造文化的编辑细胞进行研究。“干细胞的定义有两个属性:他们自我更新并能分化成功能性细胞。如果你修改的干细胞,可以回到相同的干细胞池和一遍又一遍的修改,使体细胞,因为干细胞在理论上是可再生来源。如果你修改体细胞只能使用修改后的细胞有限次数,因为这样不是可再生。”
曹和生物制造
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞被广泛用作宿主细胞的单克隆抗体(mab)。最近说明赵基因组,加上合适的基因编辑方法的可用性,为CHO细胞系工程注入了新的活力。以前的努力都集中在转染、筛选和克隆,药物开发人员现在可以直接编辑在基因表达的蛋白质和其他可取的特点,和删除基因结构降低了细胞的功能蛋白质的工厂。基因组编辑也提供了一种方法来评估通过干扰rna基因功能除了击倒。
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在一个2015年的论文老海伦Kildegaard,丹麦技术大学的研究员描述使用CRISPR / Cas9基因组编辑改善蛋白质的分泌在CHO细胞,一般的方法,她相信会导致“理性设计的CHO细胞工厂。”
Kildegaard CRISPR部分,因为它的低成本、缓解和效率。“CRISPR可以同时编辑多个基因,在基因组中特定网站。取得和ZFNS工作,但效率较低。”
缺点——这已经成为急性stratospherically高价值的基因疗法市场——是复杂的专利环境CRISPR在欧盟和美国“目前还不清楚从他可以获得一个许可应用技术,“Kildegaard说,尽管曲折CRISPR技术(例如MilliporeSigma产品)可能会改变知识产权环境。“另一个问题在我看来,如果技术非常有效的削减在基因组中太多的网站,这可能导致意想不到的易位和其他基因突变影响性能和也许稳定细胞系的。”
这正是磕碰CRISPR基因治疗,怀疑,最近被证实。
在最近的一篇论文自然方法1作者写道:“关于二次突变的担忧仍然存在地区不单一的目标指导RNA……我们发现一个意想不到的单核苷酸变异…而被广泛接受的假设CRISPR原因大多indels地区sgRNA同源。”
与一个复杂的细胞像赵和文化系统,什么基因编辑删除往往是它可以添加什么一样重要。”删除不必要的基因是特别强大的,例如FUT8基因,添加海藻糖糖基化的蛋白质“Kildegaard说。Fucosylated比non-fucosylated抗体抗体通常是不那么有效,而且更免疫原性。
糖基化在治疗性抗体通常是一个热门话题,尤其是相关的安全性和有效性。哺乳动物表达细胞的基因编辑大大减少了时间和精力参与创建抗体与“设计师”的糖基化模式。
可能整合基因精确也降低了随机影响的集成,生成的传统方法生产的细胞系。随机整合带来了大量的克隆变化和难以控制。“目标集成绕开不确定性但你仍然需要一个合适的地点和良好的向量的元素来实现你的插入基因的高表达,“Kildegaard补充道。
CRISPR比赵是有效的在其他哺乳动物细胞系,如人类和老鼠,和适用于微生物和昆虫细胞。它还适用于细菌但需要克服的困难细菌细胞修复双链断裂。
的:二次通路
沿着曲折的通路中基因和蛋白质之间曹机制负责体积生产率(蛋白质输出单位体积)被认为是最高目标进行编辑。然而根据Angelika博士haus,斯图加特大学的细胞生物学家,分泌细胞生产率的途径是一个重要的瓶颈。haus显示瞬时表达的一个小沉默RNA, mitosrna - 1978,在antibody-expressing CHO细胞提高生产力。mitosrna - 1978沉默两个基因,从而诱导转化镇压和/或退化的信使RNA参与分泌机制。
haus的基因击倒nucleofection雇用,不是一个“三巨头”基因的编辑方法。但却吸引了勃林格殷格翰集团制药——也许对其适用性和其他哺乳动物细胞系和蛋白质,或通过其潜在翻译基因编辑策略,特别是删除mitosRNA的两个目标。“我们没有测试其他生产细胞。然而,我们显示我们的工程与产品无关的影响策略,“haus说。
由于其广泛的,整个系统的影响,压制小监管rna将成为一个重大的战略,将次要的目标细胞功能相关治疗性蛋白质产量和质量。“CRISPR / Cas9技术将很有可能在未来进一步优化更大的效率和更少的脱靶效应,”西蒙•费希尔博士说细胞培养发展科学家勃林格殷格翰集团制药(殷格翰集团、德国)。microRNA淘汰赛中可能会更加突出,因为你可以调节整个细胞通路通过击出一个microRNA。其他目标包括那些与产品质量相关的像糖基化”。
这个想法已经被进一步提高生产率的连锁基因编辑由韩国研究小组,已使用CRISPR删除来自CHO细胞的基因抑制细胞悬浮培养的适应性。大田李和同事在公立大学(韩国)证明没有赵途径,无论多么模糊,能抵抗基因编辑的力量。
结论
基因编辑添加一个新的,强大的细胞培养研究和细胞生产能力。通过允许直接删除和添加特定的基因,编辑湮没了细胞系发展的传统模式,包括先天或后天?围绕这个问题的争论一直负责连续和持续改善主力像CHO细胞系。而不是解决自然提供的表型,或者可以通过传统的基因插入,科学家现在可以创建精确的正是他们所需要的细胞模型。的精度和选择性CRISPR ZFN,取得而且改变了科学家们如何看待基因工程,包括如何使转染细胞,选择那些适合克隆。最终对基因编辑是基因疗法快速吸收,市场承诺但目前有限的结果。
1Schaefer K et al。自然的方法。14卷,没有。2017年6月6日。547 - 8页。在访问https://goo.gl/PG7Y1Z
安吉洛DePalma是一个自由作家生活在牛顿,新泽西,美国。
