肿瘤学研究人员:你从你的数字PCR获得最数据?

癌症似乎可以改变在眨眼之间,使检测和监测对时间非常敏感。快速、灵敏、准确的肿瘤的DNA测试,癌症研究人员越来越多地依赖于数字PCR (dPCR)。然而,当这些测量,几乎没有犯错的空间。在这里,我们将讨论什么好dPCR数据看来,不合格的设备如何偏离数据质量和肿瘤学研究人员可以做些什么来获得高质量的dPCR数据将提供准确、有效的洞察肿瘤负荷。

只有最好的:DNA测试必须是一流的

对许多癌症来说,越早开始治疗,治疗窗口越大更有可能的一个病人是生存。然而,根据肿瘤的基因组成,一些治疗方法可能比其他人更有效。下一代测序技术可以加速的选择适当的治疗通过识别分子生物标志物在肿瘤驾驶疾病或使其耐药。

随后,许多研究人员正在探索使用非侵入性的技术称为液体活检来跟踪这些生物标志物。这种技术对循环肿瘤DNA (ctDNA)来衡量生物标志物在血液和其他体液。液体活检数据能够让你了解肿瘤负荷,显示预后、指导治疗决策当管理选择治疗和多长时间。这些见解有巨大的潜力,使更有效,在未来个性化的癌症治疗。

ctDNA发生在微量液体活检样本,所以它是使用高度敏感的关键技术,如dPCR,以确保准确的结果。然而,当比较众多dPCR可用的系统,不同的仪器设计产生的数据精度不同,准确性和灵敏度。不一致的数据破坏了压倒性的成功在生物标志物的研究作为一个整体来看待。最终,对液体活检转向标准临床使用,肿瘤学研究人员需要工具和试剂,可以依靠生产最高品质的生物标志物数据成为可能。

不同的数据从不同的乐器

所有dPCR方法旨在实现非常准确和精确的核酸检测,提供绝对量化目标物种。dPCR试验包括分区样本成成千上万的独立的单位,每个包含一个或几个DNA链。可以在微阵列,在微流控芯片,在定量PCR-like微流控盘,或者对于液滴数字PCR (ddPCR),在油水乳液。接下来,PCR反应发生在每个分区和目标核酸荧光探针放大。结束时的反应,为积极或消极的荧光分区评价。研究人员使用泊松统计信息来确定目标核酸的浓度在原始样本。

与定量PCR (qPCR) dPCR化验不需要人员来运行他们的样品与标准曲线解释结果,减少人为错误的可能性。它还使高灵敏度和高检测极限dPCR化验的可能,使他们能够评估样本含有少于百分之一的目标物种- - - - - -这通常是液体活检样本。

与任何技术一样,类型的仪器、试剂的质量和用户的能力都会影响与dPCR液体活检评估的可靠性。因为某些元素dPCR仪器和分析不同,并不是所有的仪器会产生数据相同的质量。虽然比选择一个系统,以低成本生产结果,用一个简单的工作流和低sample-to-results时间,研究人员还必须优先考虑ctDNA测试选择乐器的质量将增加真正的了解他们的研究。

底线是:研究人员只能作用于生物标记数据如果他们能信任他们dPCR化验的结果。所以,良好的数据看起来像什么?

如何区分好的和坏的数据

dPCR应该二进制数据,也就是说,积极的和消极的点图显然是由一个阈值(图1)。坏dPCR数据集有一个可怜的正面和负面的分区之间分离,可能显示一个很大的噪音,使一个阈值具有挑战性。坏数据可能来自几个问题,如故障分析仪器或抑制剂影响分析。当这种情况发生时,研究人员必须重复试验,延迟时间敏感关键信息如何响应肿瘤治疗和花费更多的钱。

良好的数据	错误数据
图1:一个好的数据集的例子。来源:Bio-Rad	图2:一个糟糕的数据集的例子。来源:Bio-Rad
紧密的和一致的振幅为积极的和消极的分区启用简单阈值设置 正面和负面的分区之间振幅分离提供了对结果的信心	不一致的振幅在分区类型使科学家很难设定阈值与信心 分区之间缺乏分离意味着轻微阈值的变化可以改变结果,防止准确量化

坏数据以各种形式出现,可以提供洞察问题(图2)的来源。试图解释这些类型的数据有很高的不准确量化风险。

●随机积极分区出现分散像图上的雨。这个问题发生在目标放大DNA在跨分区可变利率。这可能表明low-specificity化验,可怜的样本分区或仪器噪音。因为积极的和消极的分区融合在一起,它不容易画一个阈值,降低了检测极限。

●硬件不稳定可能会导致不一致的振幅在积极的和消极的分区,使其清楚画的阈值。一个有经验的用户必须手动企图把阈值和解释结果的结果。然而,这介绍了人为错误的可能性,从而降低灵敏度。

●噪音和光不稳定导致数据与负面数据点集群高于阈值。这类数据通常结果从泡沫,固体污染物或光学仪器的问题。再一次,一个训练有素的用户可以手动理解这些结果,但过程占用研究员的宝贵的时间和引入了人为错误,降低了检测灵敏度。

●交叉污染发生在目标DNA从一个分区转移到邻近的一个。从用户错误可能出现这个问题,环境因素或样品分散由仪器本身造成的。交叉污染导致了负面分区出现真正积极的,从而无法信任的结果。研究人员可以确定交叉污染已经影响了他们的分析通过查看没有模板控制,不应产生积极的数据点。dPCR运行在微阵列检测和板芯片尤其容易发生这个问题,而ddPCR化验在油水乳剂不执行。

为什么好的数据重要ctDNA测试?

非常有前途的研究领域目标在癌症治疗使用ctDNA测试:在新辅助治疗快速评估肿瘤状态和药物疗效,治疗过程后测量残余肿瘤负荷,在长期监测肿瘤复发尽可能早。这项研究不受阻碍地继续进行下去,成为一个标准在临床护理中,使用的关键技术,将产生最高质量数据来确定每一种方法的效用。

通过将高质量的仪器、试剂和方法推进工作,肿瘤学研究人员可以自信地前进,跟上癌症治疗的时间敏感性质。通过这种方式,他们可以确保他们的工作将不断改善未来的癌症患者的护理标准。