在基因组中航行，寻找安全的港湾

细胞和基因疗法有望对现代医学产生重大影响，具有治疗一系列临床需求未得到满足的不同疾病的潜力。

然而，经批准的、临床采用的细胞和基因疗法的数量与实际数量相比微不足道目前正在开发中．这种疗法转化的一个主要障碍是将治疗基因安全整合到人类基因组中。插入治疗基因有“脱靶”效应的风险，或者基因整合到一个意想不到的位置。

一个不同策略的数量已经被提出来减轻这种影响。最近的工作来自于一个合作哈佛大学威斯生物工程研究所，哈佛医学院(HMS)和瑞士苏黎世联邦理工学院．

发表在单元报告方法，这项研究的重点是识别基因组中的“安全点”。这些位置被称为基因组安全港(GSHs)，是基因组中满足以下标准的区域:它们可以通过基因组编辑策略轻松访问，与具有功能特性的基因处于安全距离内，并且只有当基因“着陆”在港口时才允许治疗基因的表达。打个简单的比方，决定在哪个港口停靠一艘船——有很多考虑因素，这些取决于你航行的船的类型、天气条件和进出的便利程度。

研究小组采用计算策略，能够识别2000个预测的gsh。通过这一初步鉴定，他们成功地验证了其中两个地点在体外而且在活的有机体内使用报告蛋白。

188金宝搏备用采访了该研究的第一作者，Erik Aznauryan博士，实验室研究员George Church教授在哈佛医学院Aznauryan深入研究了谷胱甘肽研究的历史、验证谷胱甘肽位点的方法以及这项研究的潜在应用。

莫莉·坎贝尔(主持人):你能谈谈基因组安全港研究的历史，以及它们是如何被发现的吗?

Erik Aznauryan (EA):在先前的研究中，通过经验鉴定了三个基因组位点，以支持人类细胞中感兴趣的基因的稳定表达:AAVS1，CCR5而且hRosa26．所有这些例子都是在没有对它们所在的基因组位点进行任何先验安全评估的情况下建立的。

已经尝试确定人类谷胱甘肽位点，以满足各种安全标准，从而避免现有位点的缺点。Sadelain及其同事开发的一种方法是将β -球蛋白和绿色荧光蛋白基因慢病毒转导到诱导多能干细胞(iPSCs)中，然后根据它们与基因组中各种编码和调控元件(如癌症基因、mirna和超保守区域)的线性距离评估整合位点。

他们发现了一个慢病毒整合位点，该位点满足所有提出的标准，证明了iPSCs在红系分化时的持续表达。然而，没有评估整合到该位点的转基因细胞的整体转录组谱改变。Weiss和同事采用了类似的方法，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中使用慢病毒集成来识别支持生物技术应用的长期蛋白质表达的位点(例如，重组单克隆抗体的生产)。虽然这项研究对CHO细胞中持久性、高水平转基因表达的多个位点进行了评估，但没有对人类基因组位点进行推断。

另一项研究旨在通过生物信息学搜索mCreI位点来识别GSH, mCreI位点是在满足GSH标准的位点上发现的I-CreI归巢内切酶的单体版本所靶向的区域，并在绿藻中发现并描述为能够产生靶向的交错双链DNA断裂。像以前的工作一样，几个稳定表达的位点被确定，并被提出用于人类合成生物学的应用。然而，这些位点整合事件后的局部和全局基因表达谱还没有进行。

所有这些潜在的GSH位点都有一个共同的局限性，即被基于慢病毒或mcrei的整合机制所缩小。此外，对其中一些已确定的地点以及以前建立的地点进行安全评估AAVS1，CCR5而且Rosa26，通过评估仅位于这些整合位点附近的基因的差异基因表达来进行，而没有观察整合后的整体转录组变化。

基于已建立的标准，在生物信息学指导下对GSH位点进行更全面的全基因组搜索，随后对各种细胞类型的转基因表达持久性进行实验评估，并使用全球转录组分析进行安全性评估，因此，将导致鉴定出更可靠和临床有用的基因组区域。

MC:如果gsh不编码蛋白质，或在基因表达或其他细胞过程中有功能的rna，那么它们在基因组中的功能是什么?

EA:除了蛋白质编码、功能性RNA编码、人类基因组的调控和结构区域外，还存在其他不太为人所知和不活跃的DNA区域。

人类基因组的很大一部分似乎是在各种整合病毒的存在下进化而来的，这些病毒在数百万年的时间里将DNA插入真核生物基因组，导致了大量非编码元素的建立，我们一直携带到今天。此外，功能性人类基因的部分复制导致了非活性假基因的形成，这些假基因在基因组中占据空间，但不知道具有细胞功能。

最后，人类基因组中一些非编码部分的功能角色还没有被很好地理解。我们对安全港湾的搜索是使用现有的人类基因组注释进行的，随着它的更多成分被破译，基因插入安全的基因组区域的识别将变得更加明智。

MC:你能否讨论一下为什么基因组的某些区域以前被认为是gsh，而现在被认为是非gsh ?

EA:在没有其他选择的情况下AAVS1, CCR5而且hRosa26这些位点在历史上被称为gsh，因为它们支持在多种细胞类型中感兴趣的基因的表达，并且适合在研究环境中使用。

然而，它们的警告(主要是位于功能基因的内含子内，被其他已知的蛋白质编码基因和致癌基因紧密包围)阻止了它们用于临床应用。因此，在我们的论文中，我们不称它们为gsh，而是将我们新发现的地点称为gsh。

MC:你彻底扫描了基因组，以确定潜在的gsh的候选位点进行进一步研究。你能谈谈你们在这里采用的一些技术方法吗?为什么?

EA:我们使用了几个公开的数据库，根据我们在研究开始时概述的GSH标准(外部基因、致癌基因、lncrna等)，确定了人类基因组的结构、调控和编码成分的基因组坐标。我们使用这些坐标和生物信息学工具——比如命令行的床工具——来排除这些基因组元素以及与它们相邻的区域。这给我们留下了基因组区域——假定的gsh——然后我们可以通过实验验证，将报告基因和治疗基因插入其中，然后对gsh整合和非整合的细胞进行转录组分析。

MC:你把搜索范围缩小到五个测试，然后是两个gsh。当你在细胞系中评估两个gsh时，你能扩展你对报告基因的选择吗?

EA:通常在研究中，你会使用现有的或你目前工作的实验室最感兴趣的东西。

我们的病例也不例外，我们最初(直到T细胞工作)使用mRuby报告基因，因为它被广泛使用，并在我们苏黎世联邦理工学院的实验室得到了广泛的应用和验证。

当我搬到哈佛的维斯研究所时，我开始与Denitsa Milanova博士他感兴趣的是在皮肤基因治疗的背景下测试这些位点，特别是对连接不同皮肤层的各种锚定蛋白突变引起的结缔组织大疱性表皮松解症的治疗，其中包括LAMB3基因。为此，我们决定将该基因与绿色荧光蛋白一起在人真皮成纤维细胞中表达，以直观地确认其表达。我们希望能够将这项研究转化为临床应用。

MC:你能举例说明gsh如何应用于潜在的治疗方法吗?

EA:目前的细胞治疗方法依赖于将感兴趣的基因随机插入人类基因组。这可能与潜在的副作用有关，包括治疗细胞的癌变以及插入基因的最终沉默。

我们希望目前的细胞疗法将最终过渡到治疗性基因插入精确到我们的gsh，这将缓解上述两种担忧。具体的实施领域可能涉及更安全的用于癌症治疗的T细胞工程:插入编码靶向肿瘤细胞的受体或能够增强抗肿瘤反应的细胞因子的基因。

此外，这些位点可用于皮肤细胞的工程治疗(如前所述LAMB3例如)以及抗衰老应用，例如导致年轻皮肤表型的基因表达。

最后，考虑到我们所识别位点的基因表达的稳健性，它们可以用于工业规模的生物制造:在人类细胞系中高产出感兴趣的蛋白质，用于后续的提取和治疗应用(例如，为血友病患者生产凝血因子)。

MC:现阶段的研究有什么局限性吗?

EA:这项研究的一个主要限制是使用基于crispr的敲入工具进行基因组整合事件的频率较低。这就意味着，将目标基因成功整合到谷胱甘肽中的细胞，必须在没有这种整合的情况下，从更大的细胞群中提取出来。

这些分离的细胞将被扩增以产生同质的基因细胞群。这样的管道对于临床环境并不理想，需要提高基因整合效率，以帮助这项技术更容易地转化为临床。

我们的实验室目前正致力于开发基因组工程工具，最终将能够高精度和高效地将大基因整合到gsh中。

MC:这项研究对细胞和基因治疗的发展空间有什么影响?

EA:这项研究将有望引导许多研究人员在该领域测试我们的位点，在其他治疗相关的细胞类型中验证它们，并最终将它们用于研究和临床，作为目前基于病毒的随机基因插入方法的更可靠、持久和安全的替代品。

此外，由于在我们的工作中，我们共享了由计算管道识别的所有假定的GSH，我们希望研究人员能够尝试通过实现我们在论文中概述的GSH评估管道来测试我们尚未验证的站点。这将导致鉴定出更多具有更好特性的gsh，用于临床转化或生物制造。

MC:在推进这项工作的下一步是什么?

我们希望有一天能翻译我们的成功在体外皮肤结果，开始使用这些gsh在一个在活的有机体内上下文。

此外，我们期待着提高与gsh的整合效率，这将进一步支持我们站点的临床过渡。

最后，我们将评估我们的gsh用于大规模生产治疗相关蛋白的可用性，从而改善生物制剂的制造管道。

Erik Aznauryan博士接受了技术网络高级科学作家Molly Campbell的采访。188金宝搏备用