进步推动CRISPR革命
CRISPR-based基因编辑已经实现在科学界在过去的5年。尽管CRISPR相对比较容易和高效前基因编辑方法相比,研究人员正在继续改善技术。新的进步是为了使不同类型的基因变化,提高效率,提高交付CRISPR不同的治疗方法。
用于生成模型诱导Cas9提供了更多的选择
CRISPR是生成模型的一个常见应用系统在实验室里研究生物过程或疾病。它的最初形式Cas9使在DNA双链断裂的网站是由导游RNA序列(gRNA)。CRISPR如此受欢迎的一个原因是,只需要针对不同的基因改变gRNA的顺序。然而,研究人员通常很有用也控制时间和/或编辑的解剖位置,诱导模型已经开发的Cas9只是激活体内引入小分子。
最近,研究人员一直在探索方法诱导Cas9活动只有在选定的内细胞群有机体。一个测试方法结合与CRISPR-Cas9 microrna的开关系统。这允许Cas9感应,因此基因编辑,在一个特定的细胞类型或特定状态的细胞中,在一个异构的人口。在miR-Cas9-ON系统中,翻译Cas9被激活来响应特定的microrna的,和只会编辑表示,microrna的细胞。还有一个miR-Cas9-OFF版本的系统,其中Cas9缺乏特定的microrna的表达,并且可以结合gRNA针对荧光记者等的细胞,只有细胞microrna的表达将继续表达荧光标记。
这种方法需要知识的microrna的表达感兴趣的细胞,有时研究人员可能想要控制时间根据细胞类型以外的因素。斯坦福大学的迈克尔·林博士和他的团队试图解决这个问题。“我们认为Cas9生物学家想要更精确的工具或激活基因在特定的位置,我们将努力让它强劲的光控制。我们已经开发出一种方法来创建单链photoswitchable蛋白质和我们认为它可能会应用光学控制Cas9”,林博士说。限制Cas9活动的具体时间和地点,他的团队策划多个Cas9变异对特定波长的光。这些photoswitchable Cas9品种可用于目标或激活多个基因同时,使不同的扰动取决于所使用的特定形式的Cas9。
编辑(epi)基因组双链断裂
传统的CRISPR-Cas9方法包括在DNA双链断裂,但这可能导致负面影响细胞和用于生成所需的编辑并不总是必要的。催化地融合的活动(“死”)Cas9 (dCas9)蛋白质域功能,如转录监管机构、核苷脱氨酶,或表观遗传作家用来进行其他更改没有诱导基因组和表观基因组DNA双链断裂。
由组蛋白修饰的融合蛋白质表观基因组编辑已经使用了数年,但此前缺乏时间控制。实现时间控制在一个可定制的表观基因组编辑系统,研究人员使用了脱落酸(ABA)系统结合dCas9和组蛋白乙酰转移酶通过融合dCas9所有,阿坝系统的一个组件,以及组蛋白乙酰转移酶ABI, ABA的另一个组件系统。然后介绍gRNAs感兴趣的目标区域,指导dCas9 DNA,和在体内脱落酸所有ABI域名绑定,使组蛋白乙酰转移酶乙酰化物附近组蛋白尾巴。ABA的可逆性研究系统允许的稳定工程组蛋白乙酰化作用,随着酶不会呆在长期目标区域。脱落酸的清除,停止和研究人员可以识别的交互不仅发生在组蛋白乙酰化反应,但也有稳定的变更及其影响。
类似的方法可以用来改变DNA序列。融合的dCas9核苷脱氨酶用于一个系统被称为基本编辑在目标区域,包括改变核苷酸没有双链断裂。这种方法拥有更大的潜力,但遭受低效率在某些细胞类型。道琼斯威尔康奈尔医学实验室的解决这个问题优化基本编辑。玛丽亚巴斯Zafra博士在实验室和博士后co-first作者,说:“我们开始添加一个核本地化信号(NLS),但密码子优化是改变游戏规则。这是一个非常简单和基本的想法,但它改变了一切。”这些优化提高效率的基本编辑在多种细胞类型,根据艾玛Schatoff, MD /博士生在实验室和co-first作者,“这将使得未来的研究方向,因为它允许我们模型特定的癌症病人发现突变,并比较不同的突变在同一个基因快速、轻松地”。
CRISPR疗法的进步
对于一些治疗应用程序,例如使用修改后嵌合抗原受体T (T)车细胞,特定的细胞可以从一个病人,删除与CRISPR编辑,返回给病人。在某些组织,腺相关病毒可用于交付CRISPR组件进入细胞体内。然而,这并不适用于每一个组织,并携带额外的风险。新方法交付CRISPR组件的体内正在开发推进CRISPR疗法。
这样的一个方法是通过核糖核蛋白CRISPR组件的交付(rnp),这已经被陈实验室应用生物科学研究所北京。根据实验室负责人Ting Chen博士”rnp /病毒运载系统的最大优势是,不会有病毒基因组DNA整合到宿主基因组。rnp的一半生活也会比virus-expressed短基因编辑机械的脱靶效应可能会减少”。她的实验室使用rnp针对老鼠的皮肤干细胞与隐性瘠薄表皮松解大疱(RDEB),并显著改善皮肤水泡在这些小鼠表型。仍然有工作要做在这之前有前途的技术可以进入诊所,如扩大面积,可以针对一次。陈技术的潜力持乐观态度:“从理论上讲,一旦交付问题已经解决了,可以治愈任何遗传性皮肤病”。
RDEB等隐性疾病,修复由CRISPR突变等位基因可能会导致临床改善。对于癌症由显性突变,突变等位基因需要纠正而non-mutated等位基因,以及附近的野生型细胞。在某些情况下,如KRAS基因突变,从而导致细胞不断增殖,有天然gRNA目标网站,只有发生在变异的等位基因,可以CRISPR的目标。在另一个案例中,研究人员利用protospacer相邻的主题(PAM)的特异性,Cas9减少所需。目标序列本身可以容忍gRNA之间的不匹配和DNA序列,这意味着non-mutant等位基因被修改的风险。在针对表皮生长因子受体突变,通常与癌症,研究人员在实验室调查使用gRNA针对PAM序列,这仅仅是现在,因为它是由突变,这意味着Cas9只能目标突变等位基因。在这两种情况下,疾病负担减少在老鼠模型中,而不是消除。未能完全消除疾病可能是由于基因编辑的效率低于100%,或可能是因为修复KRAS突变或EGFR不足以消除疾病。许多疗法并没有有效的隔离,这种策略可能工作更有效地结合其他疗法。
CRISPR在治疗中使用的另一个令人兴奋的可能性是异种移植克服一些障碍。使用猪器官,与人体器官大小相仿,异种移植是目前行不通的部分原因是猪内源性逆转录病毒(恋物癖)传播的风险。研究人员eGenesis使用CRISPR作为一个方法来解决这个问题,通过生成PERV-inactivated猪。猪异种移植其他障碍依然存在,但这是一个一步猪器官的安全使用。
CRISPR-based技术将继续提高在不同的上下文中使用,结合其他技术在生物医学研究创新的方法来解决问题,医学,等等。展望未来,研究人员将不得不应对使用CRISPR的伦理问题在人类和这些新的和令人兴奋的CRISPR疗法的成本。
