细胞培养的培养:小心不要污染!

在体外细胞培养是基础和生物医学研究的一个重要方面。细胞培养可以很容易和快速地用于验证假设和收集初步数据之前更费时在活的有机体内实验。它也是一种有用的筛选工具，例如药物筛选或基因实验，由于易于扩展和适应高通量。细胞培养对研究的重要性不可低估。然而，它经常被视为更重要或更明确的序曲在活的有机体内实验。尽管有这样的印象，它仍然是至关重要的投入严格和细心在体外实验，为以后的实验打下基础。因此，有必要应用最高标准的细胞培养技术．研究人员必须考虑一些因素在体外实验。选择最合适的当前项目的细胞系或原代培养只是第一步。然后，研究人员必须保持警惕，防止污染培养物，从最初的电镀时刻到整个连续的传代。

文化污染

培养污染的一个来源是由于拙劣的实验技术或严重的人为错误而无意中引入另一种细胞系。密歇根大学儿科血液学/肿瘤科儿科胶质瘤研究研究员Vivekan Nand Yadav博士解释说:“这是癌症研究中真正值得关注的问题。”“这种所谓的例子有很多 有问题的细胞系 它被另一种细胞系污染了，这种细胞系比原来的细胞系长得更多。”一个突出和众所周知的原因，有问题的细胞系是 海拉 细胞系，来自于侵袭性宫颈腺癌。海拉细胞的增殖效率非常高，以至于它们可以超过被污染的培养物。亚达夫说:“跟踪这些有问题的细胞系很重要，因为它们困扰着生物医学研究，扰乱研究结果。”“数据库是一种很好的资源，例如 Cellosaurus 该网站上有一个页面，专门介绍有问题的细胞系 被污染或被错误识别 ．另一个良好做法是报告研究资源标识符( RRIDs )用于任何出版物中使用的细胞株。rrid是包括细胞系在内的生物资源的唯一标识符，开发它是为了提高生物医学研究的可重复性和透明度。”

细胞培养物也可能被各种微生物污染，如细菌或真菌。亚达夫说:“当你的培养物中有细菌污染时，你会立即知道。”“它们通常是非常明显和有气味的，生长得非常有效，以至于它们会让你的培养基变得浑浊。真菌污染可以通过显微镜检查来识别。酵母和丝状真菌分别呈明亮的卵形或纤维状。一个非常严重的霉菌感染也会是肉眼可见的。对于细菌和真菌问题，你必须在这一点上丢弃培养物，适当地通过生物危害，清洁培养室，检查原液，扔掉任何有污染的溶液，然后重新开始，”亚达夫建议。

他继续说:“更潜在的问题是支原体，这是一种普遍的问题这要难得多。”支原体是最小的自我复制微生物，是一种没有细胞壁的细菌，细胞壁允许它们采用多种形状，这可以在培养中伪装它们。“支原体从培养细胞中劫持营养物质，可能会影响它们的生长，基因表达以及细胞状态。这是一个需要研究的问题。例如，在我的项目中，我会调查机制肿瘤重编程和药敏在成人和儿童胶质瘤中。这些是支原体可以影响的细胞特性，这将使数据无法解释。因此，在进行实验之前，我总是确保我的培养物没有支原体污染。”

容易发现问题

在研究质量受到威胁的情况下，保持警惕至关重要。美国剑桥大学怀特黑德生物医学研究所的研究科学家Zsolt G. Venkei博士建议:“在开始一个项目之前，你需要花时间来验证你的细胞系。”“当使用实验室的新细胞系时，这一点尤其重要。细胞系的这一过程 身份验证 可以通过多种方式进行。最简单的方法，这应该整合到你的细胞培养常规，是快速视觉显微镜检查 形态 ．这是一种粗糙的方法，因为细胞系的形态并不是唯一的;然而，形状的变化可以警告污染问题。我认为最好的方法是 短串联重复 profiling，一种基于pcr的检测方法，将细胞的可变DNA微卫星配置文件与数据库相匹配。但其他基因组方法也很有用，比如 核型分型和拷贝数变异 例如通过 g带和荧光原位杂交 (鱼)”。

Venkei利用 果蝇 作为一个研究模型，并在 昆虫细胞培养 ． 细胞系来源 即细胞系的种类和组织来源，是认证过程的另一个重要方面。“当你在进行研究时，你试图回答特定模式生物或细胞系的问题。一种测试出处的方法是 同工酶 分析验证物种起源和免疫细胞化学的生物标志物 组织起源 他解释道。“通过这种方式，你已经验证了细胞系的真实性，并检查了它是否保持了解决研究问题所需的特征。”

Venkei说:“通过认证过程后，现在必须确保在通过培养物和进行实验时没有微生物污染。”“微生物污染的范围从肉眼或显微镜可见的明显的细菌和真菌，到支原体，都不容易留下明显的视觉痕迹。支原体通常难以检测显微镜，通常是检测到通过分子技术，如PCR和FISH，应该遵循一个常规的时间表，因为有有限的视觉迹象来警告可能的污染。最后,病毒有点棘手。有些病毒会引起细胞病变效应，即一种肉眼可见的形态变化。另一些可能只是简单地整合到宿主细胞DNA中，而不影响细胞形态，在这种情况下，就需要进行PCR等分子测试。”

先发制人地预防问题

通过实施适当的安全措施，几乎所有的污染问题都可以最小化。Venkei解释道:“你可以采取的第一个措施是文化本身。“确保你使用无菌塑料器皿或消毒玻璃器皿，在培养基中加入抗生素和抗真菌药，并每天检查培养基。对实验室获得的新细胞系要特别警惕。检查是否有支原体，因为一旦有污染，就很难 根除 Venkei警告说。下一步措施是确保一个干净的工作环境。始终在层流罩中工作;按照指示的窗扇水平，不要通过混乱的引擎盖和覆盖通风口阻碍流动。确保层流罩过滤器定期维修和更换。Venkei详细阐述了一些关键的保护措施: 净化 用紫外线照射引擎盖，用70%的乙醇把所有设备都装进去。确保你储存培养物的培养箱定期清洁。当你工作时，遵循良好的移液技术，以防止雾化和减少传播。穿上实验服，戴上手套，既保护你自己，也保护你的文化。”

一般来说，预防污染比根除持久性污染更直接，后者需要更极端的措施，如丢弃培养物和打开的培养基、抗生素/抗真菌药和血清瓶。珍贵的或不可替代的文化可以 打捞 ，但需要特别照顾。“这需要很多步骤，很多措施，很多工作。但这一切都必须保持高质量的细胞培养，免受污染，并确保你的研究的完整性，”Venkei总结道。