追踪和控制细胞死亡

细胞死亡平衡分裂，在多细胞和单细胞生物中都是如此。程序性细胞死亡形成胚胎发育，并通过维持细胞数量的稳态和清除受感染和受损细胞发挥保护作用。在这里，我们研究了细胞死亡的一个常见分支，凋亡，并解释了为什么研究凋亡信号的畸变对于理解和解决一系列人类病理是重要的。我们还强调了使细胞凋亡研究成为可能的技术。

细胞凋亡是一种影响广泛的现象

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，细胞被系统地分解和清除。在生理条件下，凋亡细胞清除一般是免疫沉默的，避免在局部组织引起炎症。¹就像如果你要拆除自己的房子，你会尽最大努力让你邻居的房子完好无损。凋亡细胞的清除包括吞噬细胞的招募，吞噬细胞识别和内化通常相同大小的细胞尸体。^1、2

关键的观察早在1972年就已经完成了et al。创造了“细胞凋亡”这个术语，并描述了“活跃的、固有的程序化现象”。^3.除了细胞被处理的机制外，凋亡细胞还可以通过其表现出的形态特征来识别，包括:细胞质收缩、染色质凝结、核碎裂和质膜起泡。⁴凋亡细胞分裂成膜结合的小泡，称为凋亡小体，在溶酶体内被吞噬和降解。⁵

外源性凋亡是由死亡配体与患病细胞上的死亡受体结合而诱导的(如下面的动画所示)。相反，内在凋亡是响应细胞应激而启动的，依赖于促死亡蛋白(BAK或BAX)的激活，后者在线粒体膜上形成气孔。这被称为线粒体外膜渗透(MOMP)，它允许细胞色素c从线粒体释放到细胞质中。细胞色素c激活蛋白酶和信号级联，导致细胞的破坏。^6、7

本动画探讨了诱导细胞凋亡的Fas信号转导途径。该动画发表在《科学》杂志(Molecular animation of Cell Death Mediated by The Fas Pathway, Sci)上。Stke 2007(380)。来自WEHI电影．

就像金发姑娘一样，我们不想要太多或太少;不适当的细胞凋亡水平可能会对我们的健康造成问题。近半个世纪前，Kerr和他的同事们也认识到细胞凋亡可以通过各种刺激来启动和抑制，这一观察结果是当今以细胞凋亡为重点的生物医学研究的核心。

阻断和促进细胞死亡:凋亡导向药物开发

药物开发人员一直在追逐操纵细胞凋亡的能力，这在一定程度上已经实现了。例如，用小分子诱导细胞死亡是一种临床验证的抗癌方法; Venetoclax 是一种被批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病的药物。Venetoclax通过拮抗BCL2起作用，BCL2是一种结合并抑制促凋亡蛋白和凋亡效应物的促生存蛋白。⁸另一方面，阻止细胞凋亡以防止健康细胞的死亡，在不希望发生细胞死亡的情况下，如中风、心脏病发作或器官移植后，可能是有利的。然而，防止健康细胞凋亡的努力并没有那么成功。

大多数阻止细胞凋亡的努力都集中在靶向caspases上。尽管半胱天冬酶是细胞凋亡的加速剂，但人们已经认识到半胱天冬酶对细胞死亡不是必需的。⁹沃尔特和伊莉莎·霍尔医学研究所的研究人员(也是联合开发Venetoclax,在与行业合作伙伴的合作中)证明了caspases在细胞已经致力于凋亡的关键步骤后起作用，因此追逐caspase抑制剂是徒劳的。 纪尧姆·莱辛教授 沃尔特和伊莉莎·霍尔研究所ACRF化学生物学部门的实验室负责人解释道:

“我们发现，即使你阻断了半胱天冬酶的活性，细胞最终还是会死亡，因为发生了太多的事情。特别是线粒体受损。相反，我们的化合物在细胞死亡途径中起作用的时间要早得多。”

Lessene教授和研究所的同事，包括David Huang教授和Mark van Delft博士，开始寻找一种新的方法。今年，他们报告说自然化学生物学发现了一种新的小分子，可以阻断小鼠胚胎成纤维细胞(mef)和其他细胞类型内在凋亡的早期步骤。¹⁰与caspase抑制剂不同，WEHI-9625在细胞达到凋亡的关键步骤之前阻止细胞凋亡，正如Lessene强调的那样:

“这篇论文最重要的信息是，有可能在线粒体受损之前阻止细胞凋亡。这是研究开始时的中心假设。”WEHI-9625增强了VDAC2(一种线粒体蛋白)抑制mBAK功能的能力。Walter和Eliza Hall团队相信，阻止线粒体损伤上游的细胞凋亡是一种可行的方法，他们已经在人类细胞上重复了这项研究。

测量细胞死亡的多面方法

为了发现细胞凋亡的小分子抑制剂，该团队的目标是找到防止注定死亡的细胞死亡的化合物。mef缺乏Mcl1暴露于ABT-737，一种通过特定途径触发细胞凋亡的BH3模拟化合物。通过一系列测试，研究人员缩小了近25万种化合物的范围。首先，表型筛选用于识别诱导他们正在寻找的事件的化合物，即抑制细胞死亡。Lessene解释了他们的方法:

“我们看到的是一个相当宽泛的终点，而不是一个具体的约束性事件。在我们的例子中，我们所观察的表型是逆转细胞死亡，实际上我们所做的表型筛选是将细胞推到细胞死亡的边缘，然后筛选可以逆转这种情况的化合物。表型筛选的优点是，读数正是你想要的。我们希望阻止细胞死亡，这正是我们所测量的。”

在这里，使用了几种技术来识别被ABT-737杀死的细胞。用细胞活力测定法根据ATP含量测定活细胞的数量，ATP含量与代谢活性细胞的数量成正比。荧光激活细胞分选(FACS，一种特殊类型的流式细胞仪)是另一种有价值的工具，Lessene说:

“来自FACS的标记更能表明细胞几乎已经死亡，因为细胞膜上正在发生的事情表明细胞膜的完整性开始受到影响。我们使用抗体作为蛋白质的标记，这些蛋白质应该在细胞内，但后来它们被识别为在细胞外 - - - - - - 这意味着细胞膜的完整性已经受损或受到影响，这也是细胞死亡的迹象。”

Western blot也用于检测细胞色素c，其释放是caspase激活前的一个完整事件。¹¹

通过延时显微镜发现的新机制

尽管从FACS中可以获得丰富的数据，但存在一些固有的和限制性的问题。例如，为了进行FACS分析，必须终止实验，将实验限制为产生静态端点数据。因此，研究人员正在寻求活细胞成像协议，以使研究人员能够实时观察细胞功能，避免实验终止的需要。联系 潘伟文教授 他解释了延时显微镜在他的细胞凋亡研究中的益处:

“除了通过延时显微镜监测凋亡细胞如何分裂外，我们还可以使用相同的技术检测死亡细胞如何与健康的邻近细胞相互作用。”

延时显微镜对Poon最喜欢的与凋亡相关的发现至关重要，他和他的团队观察到凋亡的单核细胞产生薄膜突起，以帮助其碎片化。¹²详述于自然 通信纸就像“串珠”，观察到“串珠”从“串珠”上剪下来形成凋亡小体。这种机制被认为促进了凋亡小体的高效分类，同时排除了核内容物(包括核内容物已被建议促进自身免疫)。¹³

自动化和多学科方法是关键

为了确定新的药物靶点，研究人员需要在单细胞和种群水平上观察不同的细胞死亡(和增殖)途径如何受到扰动的影响。Poon指出了在细胞凋亡研究中使用多种技术的重要性:“DNA碎片通常发生在细胞凋亡过程中，而不是发生在其他形式的细胞死亡(如坏死)过程中。因此，它是细胞凋亡的标志。然而，重要的是要记住，在不同的细胞死亡途径之间存在大量的交叉对话，因此，必须执行多个不同的测定来确定细胞死亡的类型。例如，使用流式细胞仪、延时显微镜和其他生化分析，以及使用针对某些途径和缺乏关键分子调节因子的细胞系/动物模型的抑制剂。”

在这一点上，Lessene强调沃尔特和伊丽莎·霍尔研究所的研究成功归功于一个多学科团队多年的工作，包括药物化学。总的来说，新的高通量技术的出现需要自动化和适当的数学分析，使研究人员能够解释和理解细胞死亡的分子机制。这反过来又产生了对质量控制新方法的巨大需求，以确保维持基于细胞的分析的质量和可重复性。

引用:

1.潘，I. K. H.，卢卡斯，C. D.，罗西，A. G.，和拉维昌德兰，K. S.(2014)。 凋亡细胞清除:基础生物学和治疗潜力。《自然评论》免疫学，14(3), 166 - 180。 https://doi.org/10.1038/nri3607
2.Arandjelovic, S. & Ravichandran, K. S.(2015)。凋亡细胞在稳态中的吞噬作用。自然免疫学，16(9), 907 - 917。 https://doi.org/10.1038/ni.3253
3.科尔，韦利，A. H.柯里(1972)。 细胞凋亡:在组织动力学中具有广泛影响的基本生物学现象。英国癌症杂志，26, 239 - 257。 https://doi.org/10.1038/bjc.1972.33
4.Galluzzi, L.， Vitale, I.， Aaronson, S. A.， Abrams, J. M.， Adam, D.， Agostinis, P.，…Kroemer, G.(2018)。细胞死亡的分子机制:细胞死亡命名委员会2018年的建议。细胞死亡与分化，25(3), 486 - 541。 https://doi.org/10.1038/s41418-017-0012-4
5.蒋丽玲，Paone, S.， Caruso, S.， Atkin-Smith, G. K.， Phan, T. K.， Hulett, M. D. & Poon, I. K.(2017)。流式细胞术测定凋亡小体的含量和细胞来源。科学报告，7(1), 14444。 https://doi.org/10.1038/s41598-017-14305-z
6.奇普克，J. E. &格林，D. R.(2008)。BCL-2蛋白如何诱导线粒体外膜通透性?细胞生物学发展趋势，18(4), 157 - 164。 https://doi.org/10.1016/j.tcb.2008.01.007
7.郝志强，麦涛万(2010)。fas介导的I型和II型凋亡通路受XIAP的差异控制。分子细胞生物学杂志，2(2), 63 - 64。 https://doi.org/10.1093/jmcb/mjp034
8.https://www.wehi.edu.au/research-research-fields/clinical-translation/venetoclax
9.埃克特，P. G.，里德，S. H.，西尔克，J.，马斯登，V. S.，考夫曼，H.，霍金斯，C. J.，……沃克斯，D. L.(2004)。Apaf-1和caspase-9加速细胞凋亡，但不能决定被剥夺因子或药物处理的细胞是否死亡。细胞生物学杂志，165(6), 835 - 842。 https://doi.org/10.1083/jcb.200312031
10.范·代尔夫特，m.f.，查帕斯，S.， Khakham, Y.， Bui, c.t.， Debrincat, m.a.， Lowes, K. N.，…Kile, b.t.(2019)。一种小分子与VDAC2相互作用，阻断小鼠bak驱动的细胞凋亡。自然化学生物学，15(11), 1057 - 1066。 https://doi.org/10.1038/s41589-019-0365-8
11.范·代尔夫特，m.f.，查帕斯，S.， Khakham, Y.， Bui, c.t.， Debrincat, m.a.， Lowes, K. N.，…Kile, b.t.(2019)。一种小分子与VDAC2相互作用，阻断小鼠bak驱动的细胞凋亡。自然化学生物学，15(11), 1057 - 1066。 https://doi.org/10.1038/s41589-019-0365-8
12.Atkin-Smith, G. K.， Tixeira, R.， Paone, S.， Mathivanan, S.， Collins, C.， Liem, M.…Poon, I. K. H.(2015)。在细胞凋亡过程中通过串珠膜结构产生细胞外囊泡的一种新机制。自然通讯，6(1), 7439。 https://doi.org/10.1038/ncomms8439
13.席勒，M.， Bekeredjian-Ding, I.， Heyder, P.， Blank, N.， Ho, A. D.， & Lorenz, H.-M.。(2008)。在细胞凋亡的早期阶段，自身抗原被转移到小的凋亡小体中。细胞死亡与分化，15(1), 183 - 191。 https://doi.org/10.1038/sj.cdd.4402239