紫外可见光谱法:原理、优点和局限性和应用程序

紫外光谱(紫外)是一种广泛使用的技术在许多领域的科学从细菌培养,药物识别和核酸纯度检查和定量,在饮料工业和化学质量控制研究。本文将描述紫外可见光谱是如何工作的,如何分析输出数据,技术的优势和局限性和它的一些应用。

紫外可见光谱分析技术措施的离散波长的紫外线或可见光吸收或者通过一个示例传播相比,一个参考或空白样品。这个属性是受样本组成,可能提供的信息在样例和浓度。因为这种光谱技术依赖于使用的光,我们首先考虑光的属性。

光有一定量的能量,其波长成反比。因此,更短的波长的光携带着更多的能量和更长的波长携带更少的能量。需要一个特定的能量来促进电子物质到一个更高的能量状态,我们可以检测吸收。电子在不同焊接环境物质要求不同的特定的能量电子提升到一个更高的能量状态。这就是为什么不同波长的光的吸收发生不同的物质。人类是能够看到可见光的光谱,从大约380海里,我们认为紫780海里,我们看到红色。¹紫外线比可见光的波长短,约100海里。因此,其波长光可以被描述,可用于紫外可见光谱分析或识别不同物质通过定位特定波长对应于最大吸光度(见紫外可见光谱的应用部分)。

紫外可见分光光度计是如何工作的?

虽然有许多变化在紫外可见分光光度计,以获得更好的理解一个UV - Vis分光光度计是如何工作的,让我们考虑的主要组件,如图1所示。

图1: 一个简化的紫外可见分光光度计的主要组件的示意图。信贷:贾斯汀博士汤姆。

光源

光学技术,一个稳定的来源能够在广泛的发光波长是至关重要的。一个氙气灯通常被用作高强度光源对紫外和可见的范围。氙气灯,然而,与更高的成本和更稳定的钨和卤素灯相比。

仪器采用两盏灯,钨或卤素灯通常用于可见光,²当一个氘灯是常见的紫外线来源。²作为两种不同的光源需要扫描紫外和可见光波长,仪器的光源必须在测量开关。在实践中,这种转换通常发生在300年和350年之间的扫描的纳米发光光源和类似的转变可以更加顺畅。

波长选择

在下一步中,某些波长的光适合样品类型和分析物检测样品检查的必须选择广泛的光源发出的波长。可用这方法包括:

• 单色仪——一个单色仪分离光波长的窄带。它通常是基于衍射光栅,可以旋转选择传入和反射角度选择所需的波长的光。^1,2衍射光栅的槽频率通常是测量槽的数量每毫米。高槽频率提供了一个更好的光学分辨率但可用波长范围相对狭窄。低槽频率提供了一个更大的可用波长范围,但更糟糕的是光学分辨率。每毫米300 - 2000凹槽用于紫外可见光谱的目的,但至少每毫米1200槽是典型的。光谱测量的质量敏感物理缺陷在光学衍射光栅和设置。因此,统治衍射光栅缺陷往往超过了全息衍射光栅。³了全息衍射光栅提供更好质量的测量。³
  
• 吸收过滤器- - - - - -吸收过滤器通常由彩色玻璃或塑料吸收特定波长的光而设计的。²
  
• 干涉滤光器- - - - - -也称为双色过滤器,这些常用的过滤器是由许多层的介电材料薄层材料之间发生干扰。这些过滤器可以用来消除不受欢迎的波长通过相消干涉,因此作为波长选择器。^1,2
  
• 截止滤光片-截止过滤器允许光线低于(shortpass)或以上(longpass)一定的波长通过。这些通常使用干扰过滤器实现。
  
• 带通滤波器带通滤波器的波长通过允许范围可以通过结合实现shortpass longpass过滤器。

单色器通常用于这个过程由于其通用性。然而,过滤器是常用的单色仪一起进一步缩小选定波长的光更精确的测量和改善信噪比。

样品分析

无论用于分光光度计波长选择器,然后通过一个示例。对所有分析,测量一个参考样本,通常被称为“空白样本”,如电池充满类似的溶剂用于准备样品,势在必行。如果一个缓冲水溶液包含样本用于测量,然后水缓冲溶液的物质利益作为参考。当检查细菌培养,无菌培养基将用作参考。参考样品信号之后使用由仪器自动帮助获得真正的分析物的吸光度值。

重要的是要注意的材料和条件用于UV - Vis光谱学实验。例如,大多数的塑料比色皿不适当的紫外线吸收研究,因为塑料一般吸收紫外线。玻璃可以作为一个过滤器,通常吸收大部分的短波紫外线(100 - 280海里)²和UVB(280 - 315海里)²但允许一些UVA(315 - 400海里)²通过。因此,石英样品持有人需要紫外检测,因为大部分的紫外线石英是透明的。空气也被认为是一个过滤器,因为光的波长短于大约200海里被分子吸收空气中的氧气。一个特殊的和更昂贵的设置需要测量波长短于200海里,通常涉及一个光学系统充满了纯氩气。Cuvette-free系统也可以使非常小的样本容量的分析,例如在DNA或RNA分析。

检测

光通过样品后,探测器是用来将光转换成可读的电子信号。一般来说,探测器是基于光电涂层或半导体。

一个光电涂层光照下带负电荷的电子。当电子喷射,电流与生成光强度成正比。光电倍增管(PMT)⁴是一个常见的检测器用于UV - Vis光谱学。^2,5PMT是基于光电效应最初弹射电子在光照,紧随其后的是顺序喷射的乘法电子产生一个更大的电流。⁴PMT探测器特别适合检测非常低水平的光。

当半导体暴露在光,光强度成正比的电流可以通过。更具体地说,光敏二极管⁶和电荷耦合装置(ccd)⁷是两个最常见的基于半导体技术的探测器。^2,5

电流后产生任何检测器,然后识别和信号输出到电脑或屏幕。图2和图3显示了一些简化示例紫外可见分光光度计的原理图安排。

图2: cuvette-based紫外可见光谱分析系统的原理图。

图3: cuvette-free紫外可见光谱分析系统的原理图。⁸

紫外可见光谱分析、吸收光谱和吸光度单位

紫外可见光谱信息可以作为吸光度的图形,光密度或透光率作为波长的函数。然而,的图提供的信息往往是垂直吸光度y在水平轴和波长x轴。这张图是通常被称为一个吸收光谱;一个例子就是如图4所示。

图4: 一个例子吸收光谱与紫外可见分光光度计。样品检测是过期的血红蛋白溶解在中性pH磷酸盐缓冲剂。信贷:贾斯汀博士汤姆。

基于UV - Vis分光光度计仪器回顾本文的在前一节中,光的强度可以合理预计将定量与光被样品吸收的量。

吸光度(一个)等于涉及一小部分光的强度的对数之前通过样例(我_o)除以光的强度经过样本(我)。这个分数我除以我_o也被称为透射率(T),这表示有多少光通过一个示例。然而,Beer-Lambert定律通常用于获得样品的浓度(c测量吸光度(后)一个摩尔吸光系数(时)ε)和路径长度(l)是已知的。通常情况下,ε表达与单位摩尔^{- 1}厘米^{- 1},l的单位是厘米,然后呢c表示单位摩尔L^{- 1}。因此,一个没有单位。

有时非盟是用来表示任意单位或吸光度单位但这是强烈劝阻。

Beer-Lambert定律获得一种物质的浓度特别有用如果存在线性关系使用一组测量的标准解决方案包含相同的物质。方程1显示了吸光度之间的数学关系,Beer-Lambert定律,光强度测量仪器,和透光率。^5,9

方程1: 一组方程显示吸光度之间的关系一个,Beer-Lambert定律,光线强度测量仪器,和透光率。

术语光密度与吸光度(OD)有时被错误地交替使用。OD和吸光度测量光强度迷失在一个光学组件,但OD考虑从光散射而吸光度不损失。如果存在很少的光散射测量,然后OD可能近似直接使用吸光度和Beer-Lambert定律可以使用。

了解实验条件在测量是很重要的。比色皿为1厘米的路径长度设计标准和最常见的。有时,很少的样本用于检查和短路径长度为1毫米是必要的。在定量是必需的,吸光度值应该小于1,在仪器的动态范围。这是因为1意味着样品的吸光度吸收入射光的90%,或者说表示10%的入射光通过样品。如此小的光到达检测器,UV - Vis分光光度计不够敏感可靠的量化少量的光线。两个简单的问题可能的解决方案是稀释样品或降低路径长度。

正如上面提到的,记录一个基线频谱使用“空白”的参考解决方案是必要的。如果仪器在各个方面都是非常完美的,基线会零每波长吸光度检查。在实际情况下,然而,基线光谱通常会有一些很小的积极和消极的吸光度值。对于最佳实践,这些小的吸光度值往往会自动从样品的吸光度值减去每个波长的光由软件来获取真正的吸光度值。¹

根据分析的目的,建设一个校准曲线可能是可取的。构建一个校准曲线需要数据分析和额外的工作,但这是非常有用的,以确定某一特定物质的浓度准确根据吸光度测量样本。然而,有许多情况下一个校准曲线没有必要包括OD测量细菌培养,以不同波长的吸光度比值为评估核酸或识别某些药品的纯度。

紫外可见光谱的波长对应的最大吸光度的目标物质是选择进行分析。这个选择保证了最大程度的敏感性,因为最大的反应是获得一个特定的分析物的浓度。¹紫外线的一个例子Vis吸收光谱的食品绿色3和使用标准的解决方案提供了相应的校准曲线如图5所示。注意两个最大吸收峰出现在食品绿色3染料,一个较小的最大吸收峰在435 nm和更强烈的最大吸收峰在619海里。时获得最大灵敏度计算未知浓度的食物绿色3,最大吸收峰在619纳米是用于分析。通过一系列已知浓度的标准解决方案是由稀释股票的解决方案,以吸光度测量,然后绘制这些图的吸光度与浓度建立数值浓度和吸光度之间的关系。创建一个校准曲线用最小二乘线性回归方程。数据点间距离越近,一条直线,越健康。直线方程的y轴截距设置为0表示没有吸光度时染料。图5所示的方程被用来计算食品绿色3(变量x)的浓度在一个未知的示例基于测量吸光度(变量y)。

图5: 紫外可见光谱的食品绿色3从样本中提取左侧所示图。校准曲线右边的图显示了从绿色食品标准稀释3使用最小二乘线性回归方程。信贷:贾斯汀博士汤姆。

进行数据分析,吸光度与浓度的图像可以显示系统的敏感程度,以构建一个校准曲线。当使用一个线性最小二乘回归方程时,最适合线的斜率表示敏感性。如果坡陡,灵敏度较高。灵敏度是能够区分小样本浓度的差异。从Beer-Lambert定律,灵敏度可以部分由摩尔吸光系数表示ε。知道了ε值之前,如果可用,可以帮助确定所需样品的浓度,特别是样品是有限的或昂贵的地方。

对可靠性和最佳实践,UV - Vis光谱学实验和数据应该重复。当重复样本的检验,一般来说,至少三个复制试验是很常见的,但在某些领域需要更多的复制工作。计算数量,如未知样品的浓度,通常报告为平均标准偏差。可重复的结果是至关重要的,以确保精确,高质量的测量。标准偏差、相对标准偏差和变异系数有助于确定精确的系统和测量。低偏差或变化表明更高层次的精度和可靠性。

紫外可见光谱法的优点和局限性

没有一个是完美的和UV - Vis光谱的技术也不例外。然而,这项技术确实有一些下面列出的主要优势,使其受欢迎。

• 这项技术是非破坏性的,允许样本被重用或进行进一步处理或分析。
• 测量可以很快,可以很容易地集成到实验协议。
• 仪器易于使用的在使用之前,需要小用户培训。
• 数据分析通常要求最小的处理,再一次意义小用户培训是必需的。
• 仪器通常是便宜的收购并经营,使其可访问了许多实验室。

虽然这种技术似乎势不可挡的力量,也有一定的缺点:

• 杂散光——在一个真正的乐器,波长选择器并不完美和少量宽波长范围的光线从光源可能仍然是传播,¹可能导致严重的测量误差。⁹杂散光也可能来自环境或松散安装在仪器室。¹
  
• 光散射- - - - - -光散射是通常由悬浮固体在液体样品,这可能会导致严重的测量误差。存在泡沫的试管或样本会散射光线,导致不能再现的结果。
  
• 来自多个物种吸收的干扰——样品可能,例如,有多种类型的绿色颜料叶绿素。不同叶绿素将重叠光谱,研究了在相同的样本。适当的定量分析,每个化学物种应该分开单独样品和检查。
  
• 几何方面的考虑——对齐定位仪器的任何一个组件,特别是试管样本,可能产生不能复制的和不准确的结果。因此,重要的是,每个组件的工具在同一方向一致,为每一个测量放置在相同的位置。一些基本的用户培训因此通常建议避免滥用。

紫外可见光谱法的应用

UV - Vis发现自己应用于许多应用和情形包括但不限于:

DNA和RNA分析

快速验证RNA和DNA的纯度和浓度是一个特别广泛的应用程序。总结他们的分析中使用的波长和指示表1中给出。在准备DNA或RNA样本,例如下游应用,如排序,验证往往是很重要的,没有与其他的污染,或与蛋白质或化学物质从孤立的过程。

260海里/ 280海里吸光度(260/280)比率有助于揭示核酸可能污染的样本,总结在表2中。纯DNA通常有260/280的比率1.8,而纯粹的RNA的比例通常是2.0。纯DNA 260/280比率低于RNA因为胸腺嘧啶,取而代之的是尿嘧啶的RNA, 260/280的比率低于尿嘧啶。样品污染的蛋白质会降低260/280比率由于更高的吸光度在280海里。

波长吸光度分析中使用 在纳米	什么这个波长的紫外吸光度显示的存在吗?	什么原因导致这个波长的紫外吸光度?
230年	蛋白质	蛋白质的形状10
260年	DNA和RNA	腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶尿嘧啶
280年	蛋白质	主要是色氨酸和酪氨酸

表1:总结有用的紫外吸光度在确定260/280和260/230吸光度比值。

吸光度比值	典型值
260/280	1.8吸光度比典型的纯粹的DNA 2.0吸光度比典型的纯粹的RNA
260/230	吸光度比值变化;2.15到2.50典型的RNA和DNA11

表2:总结为DNA和RNA分析预期的紫外吸光度比值。

260 / 230 nm吸光度(260/230)比率也用于检查DNA和RNA样品的纯度,可能揭示蛋白质或化学污染。蛋白质可以吸收230纳米的光,从而降低260/230比率和指示在DNA和RNA蛋白质污染样品。¹⁰硫氰酸胍盐和异硫氰酸胍盐,两个常见的化合物用于净化核酸、强烈吸收在230海里也会降低260/230吸光度比值。

药物分析

最常见的一种使用的紫外可见光谱药品行业。^{12,13,14,15,16,17}特别是,使用数学处理紫外可见光谱衍生品允许将原始光谱吸收峰重叠识别个体药物解决。^12,17例如,苯坐卡因局部麻醉和金霉素,抗生素,可以同时确定商业兽医粉配方中应用的第一个数学导数吸光度光谱。¹⁷同时量化的物质可能在微克每毫升浓度范围,通过建立校准函数为每个化合物。¹⁷

细菌培养

紫外可见光谱常用于细菌培养。OD测量通常并迅速使用波长600 nm估计细胞浓度和跟踪的增长。¹⁸600海里是常用的,首选由于光学性质的细菌培养基中生长,避免损害所需的细胞的情况下继续实验。

饮料分析

识别特定化合物的紫外可见光谱的饮料是另一种常见的应用。咖啡因含量必须在一定的法律限制,^1,19紫外线可以方便量化。某些类的有色物质,如花青素发现蓝莓,覆盆子,黑莓,樱桃,很容易通过匹配识别已知的峰值波长吸光度酒使用紫外可见吸光度进行质量控制。^20.

其他应用程序

这种技术也可以用在许多其他行业。例如,测量一个颜色指数是有用的监测变压器油作为一种预防措施,确保电力安全交付。²¹测量血红蛋白的吸光度来确定血红蛋白浓度可用于癌症研究。²²在废水处理、紫外可见光谱可用于动态监测研究确保某些染料或染料-产品已被移除正确通过比较它们的光谱。²³它也发现了很大的效用食品真实性分析和空气质量监测。

UV - Vis光谱定性也有用在一些更专业的研究。跟踪波长峰值对应的吸光度的变化是有用的在检查特定的结构蛋白的变化^24,25,26在确定电池组成。²⁷峰值波长吸光度的变化也可以用于更现代的应用程序(如描述的非常小的纳米粒子。^28,29日这种技术的应用是多种多样的,看似无穷无尽。

引用

1。哈里斯。定量化学分析。7日,3日印刷。w·h·弗里曼;2007年。

2。Diffey提单,紫外线辐射的来源和测量。方法。2002,28 (1):42。doi:10.1016 / s1046 - 2023 (02) 00204 - 9

3所示。Namioka t .衍射光栅。:真空紫外光谱。卷1。实验方法在物理科学。爱思唯尔;2000:347 - 377。doi:10.1016 / b978 - 012617560 - 8/50018 - 9所示

4所示。莫蒂默阿布拉莫维茨和迈克尔·w·戴维森。光电倍增管。分子表达。2021年4月25日通过。https://micro.magnet.fsu.edu/primer/digitalimaging/concepts/photomultipliers.html

5。Picollo M,香M, Vitorino紫外可见光谱。phy Sci牧师。2019;4 (4)。doi:10.1515 / psr - 2018 - 0008

6。光电二极管是什么?工作、特点、应用。2018年10月30日在线发表。2021年4月29日通过。https://www.electronicshub.org/photodiode-working-characteristics-applications/

7所示。阿梅里奥g .电荷耦合器件。科学美国人。1974年,230 (2):22-31。http://www.jstor.org/stable/24950003

8。Hackteria。DIY NanoDrop。2021年6月15日通过。https://hackteria.org/wiki/File NanoDropConceptSpectrometer2.png

9。夏普先生在紫外可见分光光度计的杂散光。肛门化学。1984;56 (2):339 - 356。doi:10.1021 / ac00266a003

10。刘p, Avramova LV,公园重新吸光度在230 nm蛋白质展开调查。学生物化学肛门。2009,389 (2):165 - 170。doi:10.1016 / j.ab.2009.03.028

11。卡尔布V。,Bernlohr R. A New Spectrophotometric Assay for Protein in Cell Extracts.学生物化学肛门。1977;82:362 - 371。doi:10.1016 / 0003 - 2697 (77)90173 - 7

12。奥赫达博世C,桑切斯罗哈斯f .最近应用导数紫外/可见吸收分光光度法:2009 - 2011。Microchem J。2013;106:1-16。doi:10.1016 / j.microc.2012.05.012

13。多明戈C, Saurina j .概述的分析表征纳米药物输送系统:对绿色和可持续的药品:复习一下。肛门詹学报。2012;744:8-22。doi:10.1016 / j.aca.2012.07.010

14。Gaikwad J,沙玛,Hatware千伏。回顾Tazarotene的特点和分析方法:一个更新。暴击牧师肛门化学。2020、50 (1):90 - 96。doi:10.1080 / 10408347.2019.1586519

15。Gendrin C, Roggo Y,夹头C制药振动化学成像和化学计量学的应用:一个回顾。J制药生物医学肛门。2008年,48 (3):533 - 553。doi:10.1016 / j.jpba.2008.08.014

16。Lopes JA Lourenco ND,阿尔梅达CF, ibsen Pinheiro Sarraguca MC,嗯。生物反应器监测光谱技术和化学计量学:一个回顾。肛门Bioanal化学。2012,404 (4):1211 - 1237。doi:10.1007 / s00216 - 012 - 6073 - 9

17所示。奥赫达桑切斯罗哈斯F,博世c .最近发展导数紫外/可见吸收分光光度法:2004 - 2008。肛门詹学报。2009年,635 (1):22-44。doi:10.1016 / j.aca.2008.12.039

18岁。史蒂文森K,借债过度的房颤,克拉克伊本,情郎PS, Pilizota t .校准微型板块微生物增长的读者。Sci代表。2016;6 (1):38828。doi:10.1038 / srep38828

19所示。特Wondimkun z测定咖啡因的Wolaita区,埃塞俄比亚咖啡使用紫外可见分光光度计。是J:化学。2016;4 (2):59。doi:10.11648 / j.ajac.20160402.14

20.王于J, H,詹J,黄w .回顾一下最近的紫外可见和红外光谱研究葡萄酒检测和歧视。:Spectrosc启2018;53 (1):65 - 86。doi:10.1080 / 05704928.2017.1352511

21。梁Y,根据P,伽玛鲁丁M, et al。紫外可见光谱法:一种新方法来评估变压器绝缘油的颜色指数。传感器。2018;18 (7):2175。doi:10.3390 / s18072175

22。棕色的金桥,vishwanath2004 K,帕默通用,Ramanujam n .定量紫外可见光谱的进步在癌症临床和临床前应用。生物科技当今》。2009;20 (1):119 - 131。doi:10.1016 / j.copbio.2009.02.004

23。ibsen Pinheiro HM, Touraud E, Thomas o .芳香胺的偶氮染料还原:状态评估与强调直接紫外分光光度检测纺织工业废水。染料Pigm。2004,61 (2):121 - 139。doi:10.1016 / j.dyepig.2003.10.009

24。Kristo E, Hazizaj Corredig m结构变化对乳清蛋白由紫外线照射在一个连续的紫外线反应堆。J阿格利司食品化学。2012;60 (24):6204 - 6209。doi:10.1021 / jf300278k

25。兰格R, Balny c .紫外可见光谱导数在高压力。Biochim Biophys Acta BBA——蛋白质结构摩尔Enzymol。2002,1595 (2):80 - 93。doi:10.1016 / s0167 - 4838 (01) 00336 - 3

26岁。汤姆·J Jakubec PJ安德烈公顷。机制增强血红蛋白Electroactivity碳电极接触水溶性液体伯醇。肛门化学。2018,90 (9):5764 - 5772。doi:10.1021 / acs.analchem.8b00117

27。帕特尔妈妈,Demir-Cakan R, Morcrette M, Tarascon J-M, Gaberscek M, Dominko R . Li-S电池分析了UV / Vis Operando模式。ChemSusChem。2013;6 (7):1177 - 1181。doi:10.1002 / cssc.201300142

28。Begum R, Farooqi, Naseem K,等。应用UV / Vis光谱学表征和贵金属纳米粒子的催化活性捏造响应聚合物微凝胶:复习一下。暴击牧师肛门化学。2018年,48 (6):503 - 516。doi:10.1080 / 10408347.2018.1451299

29。Behzadi年代,Ghasemi F, Ghalkhani M,等。用紫外可见光谱测定纳米颗粒。纳米级。2015;7 (12):5134 - 5139。doi:10.1039 / C4NR00580E