GMCT中基因传递的微流控方法

基因修饰细胞疗法(gmct)提供了缓解症状或潜在治愈一系列疾病的潜力。与传统疗法不同，gmct是由患者供体细胞创建的，这些细胞经过修饰，以引入新的遗传物质。这种物质增加了细胞对抗疾病的能力，例如，通过指示免疫细胞靶向它们以前不会靶向的细胞。

转基因mct的发展因其创造过程中最关键的一步——遗传物质的引入——而停滞不前。通常情况下，这里已经采用了工程病毒，但由于成本和物流问题，对非病毒替代品也有需求。

最近,Indee实验室宣布发表一项研究，说明其GMCT开发和制造技术的功效《自然》科学报告．我们采访了Indee Labs的首席执行官Ryan Pawell，以了解更多关于该技术及其应用的信息。

Laura Lansdowne (LL):什么是GMCT ? GMCT目前是如何发展的?这些方法有哪些挑战?

瑞安·帕维尔(RP):gmct是利用患者自身免疫细胞的新一代疗法。通常情况下，免疫细胞取自患者，并通过转染或细胞内传递引入遗传物质进行修饰。这可以改造免疫细胞，使其靶向以前不会靶向的细胞，比如癌细胞。首批gmct代表了许多晚期疾病患者最有效的治疗平台，包括复发性和难治性白血病、非霍奇金淋巴瘤和其他血癌¹．具体来说，靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法已经在对所有先前疗法无反应的晚期急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中表现出显著的反应和可能的治愈。基因修饰的CAR-T细胞是第一个获得FDA批准的用于治疗癌症的细胞疗法，在ALL中有83%的缓解率²．

CAR-T细胞是通过对人T细胞进行基因修饰而产生的，以显示与铰链区域、一个或多个共刺激结构域和细胞内激活结构域相连的细胞外抗体单链可变片段(scFv)。

图1:基因修饰细胞疗法制造过程概述，包括:(1)从供者或患者收集血液，(2)向T细胞传递基因构建物，(3)生成嵌合抗原受体T细胞或CAR-T细胞，(4)将CAR-T细胞扩展到治疗剂量，(5)将CAR-T剂量注入患者，以便(5)CAR-T细胞攻击和杀死癌细胞。由Indee Labs提供。

GMCT制造中最棘手的一步是通过T细胞转染或转导CAR表达的核酸在细胞内传递。使用慢病毒的病毒转导是目前用于临床试验的CAR-T疗法的方法。然而，这些方法在生产过程中需要大量的操作时间，并需要大量的生产中和生产后安全测试，以避免在治疗给药时输注复制能力强的病毒^3.，⁴．

莫莉·坎贝尔(MC):为什么开发替代工程病毒将新基因送入细胞的方法很重要?

总机:使用工程病毒的制造过程缓慢、昂贵、有问题，而且无法扩大规模，为未来需要gmct的所有患者提供治疗。

GMCT生产的临床和商业标准要求使用病毒，这是耗时、劳动密集型、昂贵的，并且需要大量和高度可变的交货时间^3.．此外，病毒合成的gmct需要显著的安全性、法规和释放要求，并在治疗后对患者进行长达15年的严格监测⁴．

基于非病毒的传递是病毒GMCT制造的一种有吸引力的替代方案，因为它允许在细胞内传递各种核酸结构物(DNA, RNA)和大分子(蛋白质，蛋白质复合物)到细胞中进行永久、持久或短暂的修饰⁵．此外，与当前标准相比，这些方法具有额外的优势，包括降低成本、易于扩展和大大缩短交货时间⁵．电穿孔也被证明对工程或修饰的T细胞的体内功能有不利影响⁶．

今天李华学了两个问题:微流体技术对基因修饰细胞疗法(GMCT)的研发和制造有什么影响?

总机:在考虑GMCT开发和制造的细胞内给药时，有几个实用的指标，包括:

(1)细胞恢复，

(2)细胞活力;

(3)传递或表达效率，

(4)吞吐量，和

(5)维持正常或期望的细胞状态和功能。

Indee Labs是第一个应用微流体涡流脱落(µVS)到基因传递，在此过程中流体力或流体动力条件产生µVS被用来轻轻和暂时穿孔细胞膜，允许基因以一种新的方式传递。

图2: 微流体旋涡脱落原理概述( µVS )使基因传递。其步骤包括:(1)细胞和基因混合在悬浮液中，(2)悬浮液被压缩气体驱动通过微观柱阵列产生涡流，(3)涡流破坏细胞膜，(4)基因由于细胞膜的渗透而被输送到细胞内，(5)细胞恢复。由Indee Labs提供。

具体来说，这些微流体装置使用微小的柱阵列来诱导一种称为涡脱落的著名流体动力学现象。你可以通过观察云飘过山脉或溪流流过岩石和巨石来观察自然界中的漩涡脱落。微流体涡流脱落也被用于混合液体——我们只是第一个将其应用于转染或基因传递，并因此拥有授权专利。

微流体技术正被用于积极改进传统的细胞内给药方法⁷，⁸．然而，对实用的微流体胞内输送方法的大量需求仍然存在，特别是在GMCT开发和制造的范围内。在Indee实验室，我们开发了一种水动力细胞内传递平台µVS．

我们已经优化了增强绿色荧光蛋白(EGFP) mRNA传递到人泛T细胞9的平台。我们将演示µVS结果:

1.细胞回收率高(如:96.3±1.1%，平均值±stdev);

2.细胞活力高(83.7±0.7%)

3.具有较高的EGFP表达效率(57.4±6.8%)

4.细胞内传递后，46.3±5.6%的pan T细胞恢复，存活，表达EGFP。

我们还演示了:

1.µVS不会对T细胞生长产生不利影响。

2.µVS结果显示，在T细胞类型中，EGFP的表达谱甚至相同。

3.µVS不会改变T细胞的激活谱。

现在，我们正在开发一种用户友好的µVS仪器由新南威尔士州卫生部资助，与韦斯特米德医学研究所合作进行研究和临床应用。

这些µVS这些设备有可能完全消除广泛应用基因修饰细胞疗法的两个主要障碍:成本和可扩展性。该设备还可以减少甚至消除上述许多挑战，同时提高治疗效果。

MC:当将新的遗传物质引入人类细胞时，采取了哪些措施来确保对细胞中已经存在的遗传物质没有不良影响?

总机:监测对遗传物质的损害是我们的例行公事。

用我们的µVS技术对正常的细胞状态/细胞功能几乎没有影响，在遗传水平上对细胞的影响也很小，这是由整体基因表达变化决定的。我们对71,000个基因中超过213,000个独特的转录本进行批量测序的初步数据显示，在处理的细胞中，基因表达模式的变化可以忽略不计µVS．

今天李华学了两个常用语:微流体技术对晚期癌症患者的治疗有什么影响?

总机:它将降低与治疗相关的成本和其他风险，但更重要的是，它将减少患者(在提取细胞后)等待治疗的时间。这对于病情严重的患者来说是最重要的，他们可能只有几周的生命了。此外，我们的数据显示维持T细胞状态表明gmct由µVS在体内会更有效。

MC:除了癌症治疗，GMCT还有什么其他的应用?有没有计划探索在其他疾病领域使用这种新型微流体技术?

总机:根据再生医学联盟(ARM)的数据，ARM记录的58%的临床试验是用于治疗癌症的¹⁰．其余的用于治疗其他疾病，如罕见疾病或自身免疫性疾病。除了人类之外，还有许多研究机构和治疗公司正在研究将转基因mct用于动物疾病和农业。µVS是一种平台技术，可用于所有gmct潜在应用的基因传递。

瑞安Pawell我们采访了科技网络的科学作家劳拉·伊丽莎白·兰斯顿和莫莉·坎贝尔。188金宝搏备用