提高干细胞培养生物反应器

细胞培养质量是一个关键的要求在再生医学创新方法。搅拌釜生物反应器承诺培养系统的人类诱导多能干细胞的培养和分化(hiPSCs),他们有能力生产高细胞数量,允许扩大,尖端的机会提高增长的控制参数。增加细胞密度是一个重要的组成部分,研究干细胞生物工艺。

在这次采访中,塞巴斯蒂安selz艾本德生物处理中心、战略投资组合经理生物过程,讨论了搅拌釜的细胞培养生物反应器的优势。(罗伯特Zweigerdt德国汉诺威医学院的解释了他的团队达成产量为每毫升3500万hiPSCs文化。

埃普多夫:治疗性应用程序需求高的细胞数量,因此大量的文化。在搅拌釜的优势是什么3 d文化生物反应器相比,盘子和烧瓶?

Sebastian selz:搅拌釜生物反应器是目前生物制药生产的黄金标准。有非常成熟,研究人员可以从很多文献中获利。生物反应器允许建立一个受控的环境提供最佳的细胞生长和分化的条件。识别关键工艺参数和关键质量属性的定义需要监管部门的批准。此外,搅拌釜的可伸缩性生物反应器简化了从小型过渡到更大的规模。我看到的最大的优点之一减少体力劳动。这消除了人为错误越来越多,一个安全的治疗是至关重要的。

埃普多夫:容易从静态转向搅拌釜文化和如何优化呢?

塞巴斯蒂安selz:您需要了解您的流程能够遵循设计原则和质量不仅依赖于测试产品的质量。小规模的模型应该是你的首要任务。简单的开始,例如通过测试在一个非常小的体积3 d细胞的行为。作为第一步就可以确定合适的工艺参数在文学和我们建议遵循这些建议从你的供应商和迭代中看到的,你的细胞的行为。例如,我们的客户在MH汉诺威果然做到了。他们开始与二维静态文化,然后搬到生物反应器,使用经典的过程开发方法和优化的过程。他们应用技术和方法像灌注、媒体交流,pH值控制,控制和优化的一个参数。最后,他们有一个很好的过程。然后你必须规模和保持环境稳定的细胞。为实现这一目标,重要的是确定关键工艺参数在小范围内。 We strongly advise taking a systematic process development approach.

埃普多夫:罗伯特,你的团队已经建立了专业知识在培养hiPSCs细胞聚集在搅拌釜生物反应器。最新出版,你报道达到每毫升3500万个细胞的细胞密度。这是一个巨大的飞跃!你必须克服的主要障碍达到这个里程碑?

罗伯特。Zweigerdt:我们攻击的第一障碍,十年前,就是支持生存和扩散hiPSC播种在三维(3 d) matrix-free悬浮培养,建立与培养协议采用2 d matrix-dependent单层培养传统菜肴和文化平台。^1、2

第二大步骤中,使用修改后的搅拌叶轮设计支持更均匀hiPSC聚合³随后,“retention-filter”系统。这样的保留系统使保持hPS细胞,形成多细胞聚集在了悬浮培养,在自动灌注生物反应器喂养,更换所使用的新媒体定义为常数。⁴随后,灌注喂养是我们最新的前提步骤:也就是说,生存限制参数的识别,如pH值依赖,葡萄糖消耗和乳酸积累。确定了这些生存限制瓶颈,基于反馈的监测需要执行的控制整体媒介通过灌注喂养吞吐量。我们部门的费利克斯曼施坦因博士,他是驾驶这些调查近年来,也实现了在网上过程建模和优化策略,促进理性hiPSCs高密度生物工艺的发展过程。⁵

埃普多夫:未来的使用先进的疗法,hiPSCs需要分化成所需的细胞类型。有多简单翻译差异化协议已被设计为单层培养细胞在生物反应器聚合吗?

罗伯特。Zweigerdt:自从我们开始lineage-specific差异化的发展策略在几年前悬挂,后不久,第一个成功的3 d hiPSC文化,⁶我们已经建立了相当程度的能力在这个领域。最重要的关于定向分化在悬浮培养的挑战包括细胞聚集的影响大小,其非均质性,整体细胞密度和定义机械和水动力参数。⁷

然而,我们还指出,标准的文化媒体组件和differentiation-directing分子应用,例如WNT通路调节器,用于mesendoderm-induction和心脏分化,相当于在2 d和3 d效果。⁸因此,从2 d转换过程,这通常是应用于细胞分化基础研究,3 d悬浮培养通常是简单的。然而,我们相信,在未来许多差异化策略将受益于先进的过程控制能力通过生物反应器技术,仍在开发的早期阶段。⁹

值得注意的是,我们表明,搅拌釜bioreactor-based hiPSC分化是有效地适用不仅对心脏衍射(如上突出了引用)也为许多其他功能的分化和生产hiPSC后代,包括内皮细胞、¹⁰巨噬细胞¹¹和内胚层的衍生品。¹²

埃普多夫:在上游生物工艺,喂养策略强烈影响细胞生长和生存能力。删除重复的批处理和灌注是两个选项副产品和补充营养。你认为这两种方法的优点和缺点吗?

罗伯特。Zweigerdt:正如上面提到的,我们的经验表明,灌注喂食,尽管其复杂性,是先进hPSC栽培的最优策略。¹³这是由于快速增长的高糖酵解代谢hPSC,,一方面,需要一个巨大的额外的葡萄糖供应,以避免生存限制饥饿。此外,另一方面,高葡萄糖补充导致大量分泌乳酸的积累,这可能会变得有毒,导致proliferation-inhibiting酸化的文化。这些问题增加并行指数指数增加细胞密度。⁵由于这些原因,我们认为灌注喂养是最成功的策略来控制生存限制参数,如果协议的目标是优化hiPSC高密度培养。值得注意的是,在平行于细胞密度增加10倍,所需的介质生成给定的细胞的数量,降低了70%的后果流程优化步骤。

埃普多夫:在几年之内,你可以增加hiPSC文化密度超过十倍。你是怎么优化过程来获取这个值吗?

罗伯特。Zweigerdt:几年回来,我们获得了每毫升285万hiPSCs接种后每毫升050万个细胞。最近,我们获得了超过10倍高细胞密度比较后接种密度。我们遵循一个循序渐进的策略,系统地分析了挑战,然后应用bioreactor-enabled结合的控制参数,从而克服了生存限制障碍。特定的瓶颈包括:促进有效的生存和聚合hiPSC单一细胞接种过程后,适当的适应搅拌速度以确保没有hiPSC-clumping和减少总直径低于300年~µm。接下来,避免pH值低于6.7左右,确保恒定的葡萄糖供应,以避免细胞饥饿和适应灌注速度(和促进最佳媒介吞吐量),以避免乳酸积累峰值和有毒同渗重摩水平以及一些额外的参数。⁵然而,一旦确认了这些限制,他们可以通过生物过程控制软件,系统地控制和优化的结合在网上流程建模;在我们最近的协议细节。¹⁴

埃普多夫:你能够产生52.5亿hiPSCs 150毫升容量。这个数字是如何与细胞疗法的应用程序所需的细胞的数量,例如心脏?你看到未来扩大的需要吗?

罗伯特。Zweigerdt:尽管未分化的生物工艺的实质性进展,多能hiPSCs,我们仍然致力于进一步增加细胞密度,从而产生分化细胞包括hiPSC-derived心肌细胞。虽然我们取得了非常高的血统纯洁如iPSC-cardiomyocytes > 95%,分化的细胞密度获得协议仍相对较低;目前ca。1-2x10⁶细胞每毫升。⁸因为估计表明,更换disease-depleted 1-2x10心脏细胞⁹iPSC-cardiomyocytes需要为每一个病人,我们目前需要约1升文化提供适当的细胞个体病人的剂量。再生医学的研究人员正在讨论的可能性产生非常大的细胞批次的同种异体-正常具体而言,cs方法移植的方法,我们相信这将是适当的追求一个程序在未来大幅升级。这一目标将目标卷五,十,二十,一棵橡树,最终更大的水平。

这样的升级策略也是极具吸引力的从商业的角度来看,包括过渡到完全控制GMP-conditions法规遵从性和临床所需的翻译。

另一个有前途的方法是“血细胞农业”,例如从hiPSC功能巨噬细胞的分化。正如我们最近展示了与集团合作的尼科Lachmann汉诺威医学院校园,这种方法,相比hiPSC-cardiomyocytes的批量生产,是兼容的持续生产搅拌釜的巨噬细胞生物反应器在几周甚至几个月。¹¹

埃普多夫:考虑到细胞密度,你还看到改进的余地吗?限制因素是什么?

罗伯特。Zweigerdt:如上所示,我们看到的生物工艺改进的空间分化hiPSC后代。分化的(限制)因素更加复杂而扩张的hiPSC多能性状态。原因包括高自细胞分化过程的复杂性不断改变他们的祖地位和表型,因此他们的生理和扩散性质。我们正在紧锣密鼓地开发lineage-specific工艺条件表达很多不同的血统。

这是一个挑战性的任务,但因此鼓舞人心的和令人兴奋的!

引用

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