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Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪
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热科学探索的最新创新Orbitrap Tribrid技术,使业界领先的性能,同时为所有用户提供实验性的多功能性和可用性水平。
看在Orbitrap Eclipse女士
建立在革命Orbitrap Tribrid架构,Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪是一个强大的、多才多艺的质谱分析的解决方案来帮助你准确地解决微妙的差异,区分正确的答案和很多错误的,避免昂贵的死角。
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大容量传输管(HCTT)增加离子通量进入质谱仪 |
电动离子漏斗主要离子后HCTT |
EASY-IC /要领/ PTCR离子源根据汤森放电;可靠和易于使用 |
先进活跃离子束指南防止污染物进入大规模解决四极 |
QR5分段四极滤质器与双曲表面提高灵敏度为0.4m / z前体隔离宽度 |
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Ultra-High-Field Orbitrap质量分析仪提供分辨率> 500000应用(可选> 1000年,000年应用和女士n收购率高达40 Hz;使TurboTMT和HMRn |
超高真空歧管(特高压)在特高压地区减少压力;提高离子Orbitrap质量分析仪检测 |
Ion-Routing多极使更高的收购率;执行在任何女士HCDn阶段;使变压(0.5 -20毫托)自上而下的优越性能 |
实时搜索提供动态肽识别,增加深度和TMT定量的准确性 |
修改后的双压线性离子阱让女士n离子检测离子阱和Orbitrap质量分析;敏感质量分析为多个分段模式:CID, HCD,要领/ EThcD ETciD UVPD;并为HMR前体离子隔离n。扩展的前部分高压细胞改善控制要领和PTCR反应。 |
单细胞蛋白质组学分析
单细胞蛋白质组的全面描述可以提供丰富的小说信息细胞疾病进展的背景下的发展和对治疗的反应的细胞类型的函数。然而,蛋白质组分析单细胞决议仍然是一个巨大的挑战,由于实验分析灵敏度的要求。Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪被开发以能力从ultra-low-level样本中提取无与伦比的定量数据,包括单个细胞。
的女士3基于串联质量标签(TMT)方法,增强了实时搜索,提供了吞吐量和灵敏度达到所需的蛋白质组覆盖和定量精度区分细胞类型和捕捉他们的异质性。进一步,利用小说热科学TMTpro 16丛试剂标签集可以分析,16个细胞在一个质运行,提供成千上万的单个细胞中蛋白质的定量比较。
单个细胞隔离使用流式细胞仪分选机,标签,使用Eclipse Orbitrap女士和分析
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女士的小说3工作流与实时搜索发现超过300在每个细胞差异表达蛋白质
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TMT分析两种细胞类型使用SPS女士时显示更多的差异表达蛋白质3实时搜索相比,女士2的实验。的女士3允许更精确的定量实验,使检测的细微变化更多的蛋白质为每个单独的细胞。
高分辨率的单个细胞分类SPS女士3试验实时搜索
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确认超表达已知每种类型的单个细胞的蛋白质生物标记物的下划线工作流的敏感性
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PCA情节显示无监督分类的三种细胞类型使用TMT数据。每个点对应于一个细胞的蛋白表达。情节显示清晰的分类在每种类型的细胞类型和解决异构性。这种级别的分辨率是唯一可行的使用TMT-boost * *和SPS女士3实时搜索数据采集技术。
*详情见下文TMT和实时搜索
* * Budnik et al .,基因组医学杂志。2018年,19 (1);朱et al ., 2018年,自然通讯,2018,9 (882)。
* * *总共有40个单个细胞分析在这项研究。
“一个单细胞蛋白质组学革命才刚刚开始。的组合nanoPOTS Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪,TMT试剂,SPS女士3实时搜索提供的深度报道,定量的准确性,和吞吐量需要向前推动这个新兴的领域。”
Ryan Kelly,教授,杨百翰大学,UT
宣传册:Beyond-Limited样本到单细胞蛋白质组学
热费希尔科学,我们骄傲与生命科学合作创新改变未来的人类健康。每一天。
实时搜索如何与TMT SPS女士吗3
高通量蛋白质丰度的定量比较的标准是TMT SPS女士3工作流,独有Orbitrap Tribrid质谱仪。重大进步Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪的实时搜索1,可以用来识别肽谱动态智能直接女士3数据采集,导致准确定量深度往往超过8000蛋白质16个样本/ LC / MS分析。
这个新的高通量工作流提供了增加蛋白质组覆盖提高准确度和精密度,增加的数量可量化的低级肽。
1。埃里克森et al .蛋白质组Res。2019年,18 (3)。
样品制备
LC / MS分析
多路复用的基础峰值提取离子色谱TMT样本。质分析下图中的阴影区域频谱女士强调了选择。
女士前体频谱
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在分析复杂肽混合物,coisolated离子干扰可以用狭窄的发生尽管前体隔离。Co-fragmentation前体的兴趣和干扰离子的负面影响的定量准确性TMT-based实验。2
2。停et al . Nat。方法,2011年,8(11)。
女士2
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每一个女士2频谱是审问对数据库的选择使用并行实时搜索和获取下一个女士2扫描。如果在肽匹配的搜索结果,仪器指示执行SPS女士3扫描仅使用匹配的碎片离子携带TMT标记,同时避免任何碎片可能起源于干扰离子。YLYEIAR, TMT标签被发现只有n端,SPS女士3只有在执行五b离子。
实时搜索数据采集,女士3扫描只是触发如果peptide-spectrum匹配(PSM)是确定从前面的女士2。这减少了数量的女士3前体采样率和结果事件,增加更多的量化肽;提高实验速度。
实时搜索,38%以上肽和53%的蛋白质是量化和一个典型的SPS女士3实验中,接近经典女士的结果2实验,但更高的精密度和准确度。TKO酵母显示以下数据标准(热费希尔科学)。
实时搜索指导执行女士的质谱仪3只有在确定前兆。因此,双打SPS的吞吐量3实验。这里显示的数据是一个HHM示例:三个人类细胞系贴上生物复制10丛(3-3-4)。(数据由Devin Schweppe、清,哈佛医学院)
对于每个TMT通道,4 - 100 pmol six-protein消化了40µg希拉消化,然后标记,导致停在标准的混合比率2-24(2、4、8、12、16和24)。只有结合平均的预期比率2和24所示。更高的准确性提供即时搜索是必不可少的梳理的细微差别蛋白质丰度,包括当sub-classifying单个细胞。
“Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪提供了一些令人兴奋的进步让我们执行分析100%速度显著提高量化精度。而不是36小时执行一个典型proteome-wide分析,我们现在可以完成在18个小时达到8000年和10000年之间量化蛋白质多达16个样本。这个新的质谱仪作为两种乐器,在一半的时间收集更准确的数据,但在相同或更好的深度。”
Steven p . Gygi教授,哈佛大学,硕士
本机治疗蛋白质的分析
治疗性蛋白质是成功地用于治疗各种癌症和各种自身免疫性疾病。然而,它们的结构特征提出了一个重大的挑战,因为不像基于小分子药物,他们作为一个异构混合物存在众多proteoforms修改。他们的高度复杂的ESI光谱可以简化,可通过增加分析物m / z。这可以通过执行ESI质实验在当地条件下,展开蛋白质接受更少的费用,或通过执行前体离子电荷减少质谱仪,或两者兼而有之。完整的结构表征,质谱仪不仅需要检测离子在高m / z范围,但也片段选择有效的前兆。Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪配备高质量范围n(HMRn),质子转移电荷减少(PTCR)和大量的分离技术,包括CID, HCD,要领,EThcD UVPD,最强大的系统用于治疗性蛋白质的综合表征。
简化与PTCR高度复杂的光谱
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本地MS谱完整的淡化水,唾液酸酶治疗后细胞因子Fc-fusion蛋白质包含六个N-linked糖基化的网站。原始光谱是高度复杂的,由于存在多个重叠的糖化proteoforms,使它具有挑战性的解释。高亮显示的80m / z窗口代表随后PTCR的前体离子被孤立。
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PTCR分散选择离子人口更高m / z范围,揭示个体分子离子物种较低的充电状态。这个频谱的解释提供准确信息的混合不同proteoforms难辨认的原始光谱。
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反褶积后的PTCR光谱显示(尊重™算法),一些细胞因子的改变Fc-fusion蛋白质被确定。PTCR分析整个本机充电状态的信封(m / z4000 - 7000年)导致> 30个不同的改变这种蛋白质的识别(数据未显示)
实现高序列CDR3上领域的报道
多个分离技术可以在Eclipse Orbitrap女士可以提供补充信息的主要序列,导致100%的覆盖率在CDR3上图案,增加了信心在抗体特征和提供洞察proteoform水平与不同抗原的反应性。
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本地频谱使用HMR收购n模式。27 +物种显示基线解决重大的改变。
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代表女士2光谱的27 +父离子。获得的光谱是由多个分散技术和显示不同的碎片离子模式,提供互补信息,增加蛋白质的主要氨基酸序列覆盖。
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组合碎片完整的地图从本机HCD曲妥珠单抗,要领,EThcD UVPD女士2数据。轻、重链序列覆盖率分别为58%和36%,综合报道为43%(碎片离子均方根误差< 3.7 ppm)。互补决定区(CDR) 3的轻、重链分别用红色和蓝色突出显示的地图,显示100%的序列覆盖率。验证CDR序列是必不可少的研究抗体的亲和力和有效性。
本机protein-ligand复合物的表征
配体是密不可分的监管和功能蛋白质绑定。然而,确定小分子配体与膜蛋白相关的身份是一个重大挑战,强调通过电子显微镜数据的高患病率未赋值的解决或配体密度。女士直接识别的配体在不损失ligand-protein复杂关联是困难的,因为它需要一个非常宽的质量范围,同时保留最佳离子传输完整的蛋白质的组装(成千上万的道尔顿)、准确检测小分子配体及其片段(通常分子量小于100道尔顿)。
高质量范围n能力Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪便于识别的配体与膜蛋白,允许ellucidation特定的配体与特定的蛋白质相互作用。这种方法有助于阐明配体的影响级联构成细胞的蛋白质相互作用机制,包括机制的癌症、糖尿病和老年痴呆症。
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完整的蛋白复合物从膜中提取使用洗涤剂。洗涤剂分子周围形成胶束层允许增溶的蛋白质复合体。这些胶束电离使用内西和引入质谱仪。
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完整的膜protein-ligand大会发布使用source-CID从洗涤剂胶束(伪女士2),发现在Orbitrap质量分析器。17 +父离子与配体有关孤立(灰色栏)下一个女士n的一步。
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女士3完整的膜的隔离和激活protein-ligand组装促进释放配体(m / z350.0)。这个单电荷离子是孤立的女士(灰色栏)4一步允许完整的结构特征。(注意:在这个实验中配体m / z350.0检测离子阱。Orbitrap和线性离子阱质量分析仪可用于检测离子在整个m / z范围)。
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的女士4光谱包含配体碎片离子阱中检测到。明确识别内源性配体结合的蛋白质执行使用建立小分子表征技术。这里,氨苄青霉素被绑定到大肠杆菌外膜孔蛋白F (OmpF),形成一个111 kDa protein-ligand复杂,协调其摄入量。进一步鉴定蛋白质的一级结构也可能使用这个小说自上而下的女士n的方法。
“Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪本机女士带来了一个新的维度,使我们能够发现和化学定义配体、脂质,和药物调节膜蛋白的功能组件在一个单一的实验。”
约瑟夫·高尔特博士,牛津大学,英国
减少与PTCR蛋白质质谱的复杂性
PTCR形成低父离子的电荷状态分布重叠少,更容易理解。增加可识别的前体离子的数量从原来的全光谱女士的两个物种32物种鉴定后PTCR的3m / z的范围内。新发现的质量分布在10 - 70 kDa范围(见下面的柱状图)。
PTCR所说的小说蛋白质电荷分布状态
自上而下的质谱用于直接描述完整proteoforms。ESI光谱的复杂性proteoform混合物,即使LC分离,通常很高,由于大量的重叠的形式修改m / z域。质子转移电荷减少(PTCR)技术,独特的Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪,减少的平均电荷parent-ion分布,将它们转移到更高m / z。对重叠无法区分proteoforms重叠,这减少了信号,因此,容易解释光谱得到,使proteoform质量计算。用于自动化自上而下的实验,这种方法增加了可用的可区分的前体数量视n,最终增加proteoforms特征的数量。
多个proteoforms co-elution的增加光谱的复杂性,特别是在分析蛋白质> 25 kDa。这些光谱通常无法完全解释为一些电荷状态分布的反褶积软件(例如,只有两个截然不同的群众的16和25 kDa被确定在这个光谱女士25分钟)。800 - 900年m / z区域显示了潜在的光谱的复杂性。PTCR进行两个1.5的前兆m / z窗户,以灰色和蒂尔突出显示。
PTCR启用探测proteoforms越来越大
PTCR导致显著增加的数量确定proteoforms *
女人,r . et al。肛交。化学。2019年,91年(24)。
“PTCR需要研究大proteoforms之前仍将无特征在质实验。公布真实的完整的蛋白质组的复杂性超出30 kDa障碍代表一个实质性的一步蛋白质组学社区。”
卢卡Fornelli,教授,俄克拉荷马大学好
特定于应用程序的方法只是一个点击之外
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识别、描述和量化感兴趣的化合物的质谱分析依赖于高质量的女士和女士的收购n在日益复杂的数据样本。这两位“Pro接口提高下一代的分析性能通过气相质谱仪分馏导致选择性增强目标化合物类。减少光谱的复杂性和增加信噪比目标分析物导致更大的样本覆盖和更高的数据信心,不管色谱流率或装载量。
提高质荷(m / z)比例分配精度与热科学小于1 ppm Easy-IC离子源,这包含了二次离子源提供了监管calibrant离子进入分析物离子的数量。该特性使实时微调的仪器m / z校准,否则纠正无报酬的错误由于温度波动和scan-to-scan变化。
热科学100万(M)分辨率
解决等压组件,获得良好的同位素信息,实现自信转让小分子的元素成分分析物与超高100万(1米)Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪的分辨率设置。1米分辨率选择艾滋病的表征和定量结构多样化的目标获得质量测量超高分辨率(在1000000年的半最大值宽度m / z200)。
质谱Irganox 1035收购在1000000年(1米)分辨率设置(m / z200)2 s瞬态。右边的面板显示了一个+ 2的精细结构同位素在500000年和1000000年收购分辨率设置。的18O和213C同位素可以解决使用Orbitrap融合lumo和/或Orbitrap Eclipse质谱仪1 m。
客户在说什么:
实现明确的脂类物质的特征,修改后的肽和完整的蛋白质,即使在复杂的混合物,并获得独特的结构诊断信息(例如,双键),不能用CID, HCD,或EThcD。UVPD提高单一序列覆盖率超过20%,生成女士n能被探测到的碎片在线性离子阱离子阱或Orbitrap质量分析器。
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