MicroCal PEAQ-ITC(从莫尔文仪器)是最近ITC仪表模型,增强敏感性,提高清洗模块,方便分析软件相比以前MicroCal ITC系统。莫尔文仪器综合手册和视频支持使用MicroCal PEAQ-ITC和数据分析。这个技术注意补充这些手册,提供了额外的实用技巧,将有助于提高性能的MicroCal PEAQ-ITC。使用MicroCal PEAQ-ITC将有助于理解绑定能量,扩大ITC的应用。
等温滴定量热法(ITC)是其中一个最强大的和方便的热力学方法研究分子间的相互作用通过检测任何反应热量发生在ITC细胞(1 - 9)。ITC提供有价值的信息绑定亲和力,驱动力,结合化学计量学和机制,(de)水化(de)的质子化作用,与盐的互动,互动的表面区域,如蛋白质动力学和分子灵活性(1 - 8、10 - 15)。ITC遵循Michaelis-Menten动力学的能力[16]、水解[17],估计汇率(即。协会和离解率)的分子相互作用[18]进一步扩展ITC的效用不同的生物系统。
在过去的十年中,我们遇到了两个ITC仪器,VP-ITC (MicroCalTM英国,莫尔文仪器)和ITC200年(MicroCalTM莫尔文仪器,英国),明显促进了分子热力学研究协会。PEAQ-ITC (MicroCalTM莫尔文仪表、英国)最近出现的一种新的模式ITC仪器与增强敏感性,更方便清洗模块,方便分析软件[19]。因此,MicroCal PEAQ-ITC预计也将有助于我们理解绑定能量和拓宽ITC的应用。
为了获得准确和精确的ITC温谱图和数据,正确理解ITC实验使用的程序是必需的。几个综合手册PEAQ-ITC非常有用的和可用的[20]对如何成功获取信息进行实验和分析数据。我们在此提供实用和ITC的关键技巧基于我们的经验更好的性能的实验PEAQ-ITC及其分析,不解决这些手册。
一个更小的细胞体积PEAQ-ITC仪器(大约0.2毫升)比VP-ITC仪器(大约1.42毫升)非常有利;它减少了所需的样品和实验时间和允许测量热量的变化,使用VP-ITC并不清楚地观察到,如相关的热稀释高浓度的盐(图1)。较低的分子间相互作用关联要求ITC滴定高摩尔比率,而应该使用大量的样本。快速平衡和测量最大化ITC的数量测量计算标准差和研究各种样品的机会和条件在一个特定的时期。这些优势也很有效用aggregation-prone样本ITC的研究,因为他们减少的时间用于聚合。此外,较小的细胞体积PEAQ-ITC仪器有助于减少潜在的聚合成核。然而,一些问题可能遇到当执行PEAQ-ITC体积小于VP-ITC,如下所述。
图1所示。热滴定的高浓度的氯化钠由不同型号的ITC监控仪器。ITC热分析图1 M氯化钠在10 M盐酸滴定的解决方案在ITC滴定注射器蛋白质在10 M盐酸溶液在ITC细胞记录使用VP-ITC(左)和PEAQ-ITC仪器(右)。ITC山峰后最后滴定的插图所示红色和放大比较。摩尔浓度的氯化钠每次滴定VP-ITC和PEAQ-ITC测量是相同的。第一次滴定的滴定体积是2µL和20µL其他使用VP-ITC滴定,第一滴定和2.2和0.8µLµL其他使用PEAQ-ITC滴定
在ITC实验中获得的数据的较小的细胞体积PEAQ-ITC仪器将影响更大的存在和形成泡沫细胞,它可以创建基线峰值和低基线,将使用VP-ITC实验仪器。因此,细胞间隙的泡沫经常执行。然而,用户可能会觉得不容易加载一个体积小的解决方案到PEAQ-ITC细胞使用加载注射器排除泡沫,特别是那些熟悉VP-ITC,大概有7倍大细胞体积。强大的清除(即。、快速加载)可以飞溅样品溶液,导致样品损失。然而,弱清除(即。,缓慢加载)不会有效地驱逐泡沫。因此,将溶液注入细胞需要执行尽可能温柔地没有飞溅示例解决方案。旋转加载注射器是退出避免泡沫也很有用。额外的灯或灯光有助于检测泡沫,没有光的细胞单位。
装船时特别注意鼓励和清除颜色的样品,因为颜色,特别是在相对较高的浓度,可以阻碍的观察泡沫,也当泡沫样品表面活性剂等使用。实验中使用彩色膜蛋白surfactant-containing解决方案就是典型的例子。短时间内使用台式离心机离心分离和/或脱气是有效避免泡沫的生成。
重复插入和删除滴定的注射器可能最后一步确保没有气泡的样品溶液在ITC细胞的状态。如果你观察噪声ITC温谱图在平衡或初始延迟,停止测量,重复插入和删除一个滴定注射器。
滴定的体积的注射器PEAQ-ITC仪器(大约40µL)也小于VP-ITC的仪器(大约280µL)。因此,泡沫在滴定剩余的注射器PEAQ-ITC仪器的准确和精确的体积可能会影响滴定VP-ITC的不止于此。如果检测到泡沫,单击“柱塞/续杯”按钮在仪器控制栏位于底部的MicroCal PEAQ-ITC控制软件窗口并试图删除它们。短暂离心和/或脱气是有效避免泡沫的生成。
当泡沫持续下去,执行下列过程通过控制几个关键函数的ITC滴定注射器在仪器控制栏:
i .单击“柱塞下降”按钮清空滴定注射器
二世。单击“加载”按钮
注1:“加载”功能建议,因为它是伴随着脱气,这是有效消除泡沫
注2:“打开填补端口”→“柱塞下降”通常是有效的之前,执行“加载”功能
三世。如果泡沫不消除,I和II重复过程
IV。如果上述方法不工作,舒张期一直受到短的样品用台式离心机离心分离和/或脱气。检查冲头和考虑更换后用于超过200 - 300 ITC测量
如果你计划使用相同的样本在滴定注射器ITC测量后,你可以填满滴定注射器相同的样本没有清洗或冲洗注射器(即。,只是洗细胞)。冲洗后针的滴定注射器与工作方案和擦拭它,单击“柱塞下降”按钮,然后“加载”按钮。这是一个有效的方法来加载示例不引入泡沫;然而,谨慎是aggregation-prone所需样品。
用户通常与缓冲溶液冲洗ITC细胞,它不包含分析物。这是一个基本和重要的程序匹配的注射器和细胞之间的解决方案组件的解决方案,从而减少背景(即热。、控制热量)。然而,在实践中很难移除单元中的所有剩余的解决方案使用加载注射器。剩余的解决方案的影响的细胞PEAQ-ITC仪器分析物的浓度的变化将是更大的比VP-ITC乐器,因为较小的细胞体积在前者,而后者。
分析使用一个错误的样本浓度将妥协n值的评估,亲和常数(协会和离解常数),和其他热力学参数,包括(∆焓的变化H),熵(∆年代)和吉布斯自由能(∆G)具有准确性高、重现性好。为了减少这一问题,建议细胞与工作样品溶液冲洗,冲洗后用analyte-free缓冲溶液。
为了加载示例解决方案和执行后续注入消除泡沫,装入注射器插入细胞是一个必要的过程,分别由相应的样品溶液的体积装注射器的针头。如果样品溶液保持在一个单元中储层在删除加载注射器之前,细胞将样品溶液。
PEAQ-ITC仪器系统的清洗系统,主要包括清洗模块,细胞单元和控制器PC,非常高效和健壮。然而,粘稠的样本可能留在细胞储层和底部的锁紧螺母的吸管。因此,清洁细胞的水库和底部的锁紧螺母为宜,以确保清洁ITC温谱图和成功的分析(图2)。
图2。插图的锁紧螺母PEAQ-ITC吸管单位。锁紧螺母用箭头指示和标签
PEAQ-ITC系统直观的和敏感的。因此,它的感官系统中的任何缺陷,生产各种区分大小写错误消息。关于清洁步骤出现错误消息时,仔细检查每一个连接的液体线,限制的瓶子,和大量的解决方案在每个瓶子(双重去离子水,(DDW)中所描述的Contrad鲜美的14%或20%TM70年,甲醇(高效液相色谱级或纯> 99%),和液体废物)清洗模块以及清洗模块之间的连接,细胞单元和控制器PC。
6。1。恢复从滴定剩余的样品注射器通过单击“柱塞下降”按钮在仪器控制栏,清洗后的滴定注射器与工作的解决方案。
6。2。冲洗的滴定注射器与工作方案,尽可能迅速,轻轻擦拭小费不变形滴定的针注射器在ITC滴定注射器插入ITC细胞。否则,滴定液将提前与分析物反应ITC的实验。这个过程变得更重要的是当滴定液的浓度非常高。
6。3所示。给参考细胞注入DDW之前,确保细胞水库是干净的,否则DDW参考细胞可能被污染因为DDW将溢出的参比电池再充填。保持细胞单位清洁是ITC的先决条件。
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