外泌体和微泡:纳米颗粒跟踪分析表征

纳米颗粒跟踪分析(NTA)概述

NTA同时利用光散射和布朗运动的性质来获得液体悬浮液中样品的粒度分布。激光束穿过样品室，悬浮在该光束路径上的颗粒以这样一种方式散射光，通过安装有相机的20倍放大显微镜可以很容易地看到它们。摄像机的工作速度约为每秒30帧(fps)，可以在大约100 μm x 80 μm x 10 μm的视场内捕捉到以布朗运动运动的粒子的视频文件(图1)。

图1:网流分析使用的光学配置示意图。

粒子的运动是逐帧捕捉的。专有的NTA软件同时识别和跟踪每个观察到的粒子的中心，并确定每个粒子在x和y平面上移动的平均距离。该值允许确定颗粒扩散系数(Dt)，如果样品温度T和溶剂粘度η已知，则可以使用Stokes-Einstein方程(公式1)确定颗粒的球体等效流体动力直径d。

K_B是玻尔兹曼常数。

NTA不是一种询问大量粒子的集合技术，而是每个粒子单独的大小，而不考虑其他粒子的大小。图2显示了由NTA生成的大小分布概要文件的一个示例。

图2:由NTA生成的大小分布概要文件的示例。该样品的模态尺寸约为70纳米，还存在较大尺寸的颗粒。

此外，粒子的运动是在一个固定的视场(大约100 μm × 80 μm)内被大约10 μm深的光束照射。这些数字允许估计样品的散射体积;通过测量该视场内颗粒的浓度并外推到更大的体积，可以根据任何给定尺寸类别或总体总数的每毫升颗粒来实现浓度估计。

外泌体和微泡表征

虽然纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术的基本原理已经在早期的白皮书中描述过，但必须重申的是，使用高强度激光束结合低背景光学配置，可以可视化深度亚微米尺寸的颗粒，根据颗粒折射率可测量颗粒尺寸的较低范围。对于非常高折射率的颗粒，如胶体金，精确的尺寸测定可以达到15纳米直径，而对于折射率较低的颗粒，如生物来源的颗粒，如外显体，最小的可检测尺寸可能只有30-40纳米。然而，这个最小尺寸限制允许对微囊泡和外泌体的分析，其尺寸通常远低于大多数市售流式细胞仪300 nm的检测阈值。当粒子的布朗运动变得过于有限而无法精确跟踪时，通常为1-2 μm直径，则接近尺寸上限。

用来照射纳米粒子的激光可以被用来激发荧光的激光所交换，从而使带有荧光分子标记的纳米粒子被可视化、跟踪，从而通过使用适当的光学滤光片专门测量纳米粒子的大小和浓度。因此，代替通常的638纳米红色激光，532纳米绿色激光二极管可以用来激发一系列有机荧光团，而深蓝色/紫色405纳米激光二极管允许在单个基础上检测半导体CdSe纳米晶体(也称为量子点)。一个488nm的激光二极管可以类似地用来激发更多的传统染料，如在流式细胞术中使用的历史。

因此，通过使用抗体介导的荧光团标记外泌体的特定亚群，可以实现复杂混合物中的表型。在这方面特别重要的是能够通过抗体(Ab)标记来指定特定的外泌体类型，同时通过分析其布朗运动来测量外泌体的大小，这两种测量是相互独立的。还需要注意的是，无论是否标记，这些标记外泌体的浓度仍然可以恢复并与类似大小结构的总数进行比较。

NTA与流式细胞术和电镜的比较

NTA是一种绝对技术，其中纳米颗粒的大小是通过测量其动态布朗运动行为获得的，这与粒子散射的光量无关(也与粒子质量或密度无关)。当然，流式细胞术并非如此，流式细胞术的大小估计完全基于粒子散射光的强度(通常是在低角度)，因此，为了精确测量，需要使用与样品纳米颗粒折射率非常相似的粒子进行预校准，或者需要对样品纳米颗粒本身的光散射特性有重要的先验知识。因此，虽然Nolte- ' t Hoen等人(2011)描述了基于荧光的纳米级细胞源性膜囊的定量和定性流式细胞分析的发展，但NTA被用于校准该系统，以钙黄蛋白标记的脂质体制剂和cfse标记的小鼠肝炎病毒粒子，从而证明了该系统的能力。然而，广角流式细胞仪前向散射可用于较大和较高折射率的100 nm和200 nm荧光标记校准珠。该小组随后扩展了这项工作，研究CD4+ T细胞活化促进不同纳米微泡群体的差异释放(van der Vlist et al. 2012)。

van der Pol等人(2012)已经解决了用聚苯乙烯珠校准流式细胞仪在应用于微粒和外泌体研究时的有效性问题。由于聚苯乙烯微球对生物囊泡具有不同的光学性质，并且由于对产生检测信号的机制尚不完全了解，因此预期结果与观测结果存在矛盾。为了克服这些限制，这个小组试图用Mie光散射理论来建立这个模型。然而，他们发现，无论应用何种门控，在足够高的浓度下，多个小于220纳米的小泡或多个89纳米的硅珠被视为单个事件信号。他们得出结论，流式细胞术的囊泡检测归因于大的单个囊泡和小的囊泡群检测，即多个囊泡同时被激光束照射并计数为单个事件信号。蜂群检测允许集体检测比以前认为可能的更小的囊泡，并解释了流式细胞术低估囊泡浓度的发现。这一发现得到了Harrison和Gardiner(2012)评论的支持。

Gyorgy等人(2012a)分析了骨关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)和青少年特发性关节炎患者的滑液(SF)衍生的mv、血浆和SF样本，使用电子显微镜和NTA来确定SF样本中的粒度分布，并使用流细胞术“差异洗涤剂溶解”方法。他们发现，虽然不同的技术对SF样品中mv的大小分布(80-400 nm)给出了一致的结果，但NTA分析和质谱(MS)显示，大多数事件与蛋白质聚集体有关，而不是细胞来源的囊泡。

更具体地说，György等人(2012b)比较了一种改进的流式细胞术(FC)方法，以揭示关节疾病中不同的微泡(细胞来源的微粒)特征。他们承认体液中MVs的分析尚未完全标准化，并且存在许多阻碍正确评估这些结构的陷阱，他们表明EM和NTA显示骨关节炎(OA)，类风湿性关节炎(RA)和青少年特发性关节炎(JIA)患者的滑液(SF)样本中存在大量MVs以外的颗粒。有趣的是，NTA测量的总颗粒浓度比FC检测到的总颗粒浓度高两个数量级。这支持了“冰山”理论，该理论假设FC只检测到200-300 nm以上的粒子(尽管检测阈值也取决于粒子的折射率)，而SFs中的大多数粒子都低于这个范围。另一方面，NTA检测任何粒子，而FC只列举了真实的(ax阳性，Triton敏感)囊泡相关事件。他们指出，利用NTA系统的荧光能力和特异性标记，也可以分析个体群体。

Dragovic等人(2011b)首次尝试开发一种结合流式细胞术和荧光NTA的方法来表征细胞微囊泡和纳米囊泡。根据早期的工作，将人胎盘囊泡制剂与荧光标记的抗胎盘碱性磷酸酶抗体(NDOG2- qdot605)结合使用，流式细胞术显示93.5%的囊泡标记为NDOG2阳性，其中90%以上的囊泡直径低于1000纳米，主要种群直径在300-400纳米之间(Dragovic et al. 2011 1a)。然而，当对同一样品进行荧光NTA研究时，结果显示ndog2标记的囊泡大小分布在50-600 nm之间，在100 nm和180 nm处出现峰值。超离心无血小板血浆微球(n=10)的总囊泡分析显示，NTA比流式细胞术检测到的囊泡多200倍(平均囊泡大小为251±35 nm)。他们的结论是，这些结果表明，NTA比传统的流式细胞术灵敏得多，并大大扩展了其分析微囊泡和纳米囊泡的能力(Dragovic et al. 2011b)。

尽管人们普遍认为流式细胞术无法常规测量外泌体制剂，但Robert等人(2012)报道，高灵敏度的流式细胞术提供了对小尺寸微颗粒的标准化测量，最近Baj-Krzyworzeka等人(2012a)对流式细胞术用于微颗粒和外泌体研究进行了全面综述。

当前的检测和分析方法

与从体液等复杂基质中分离和纯化外泌体相关的主要问题之一是缺乏可以评估外泌体含量和浓度测量的技术。

Van der Pol等人(2010)认为，尽管科学和临床兴趣日益增加，但由于微粒和外泌体的大小低于流式细胞术等传统检测方法的范围，因此没有可用于分离、检测和表征的标准程序。他们比较了各种目前可用的和潜在适用的光学和非光学方法的理论性能，用于测定微粒和外泌体的大小、浓度、形态、生化组成和细胞起源。他的结论是，几种(组合)方法可以检测微颗粒和外泌体的临床相关特性，但由于体液的生物复杂性，分离微囊泡已被证明是极其困难的。因此，回收和污染无法可靠地量化，隔离方案也没有标准化。在对不同技术的综合比较中，他认为动态光散射(DLS)和NTA的光散射技术有可能在几分钟内测量出微泡的相对和绝对尺寸分布。另一方面，虽然拉曼光谱可以潜在地检测单个微泡的大小、浓度和生化组成，而无需标记，但测量时间在几个小时左右。从基于荧光的光学方法来看，荧光NTA (fNTA)和荧光相关光谱(FCS)有可能通过荧光抗体标记来测量绝对尺寸分布并获得生化信息，但人们认识到这并不容易实现，并且涉及到一些实际和光学问题。fNTA被认为是最适合高速检测微囊泡大小、浓度、生化组成和细胞来源的方法，特别是因为该方法可以直接确定体液中微囊泡的相关特征。

m ller(2012)最近讨论了用于研究细胞类型特异性外泌体和微囊泡(emv)的新工具的出现，并引用了许多适合分析emv的大小、密度和分子组成的技术，以及改进其从异质囊泡群体中分离和纯化的方法。此外，他认为质谱、(微)流式细胞术、原子力显微镜、纳米颗粒跟踪和生物传感技术的最新革命将极大地促进对emv中所有成分的定量和定性分析。最好是为EMV子集提供特定签名的技术，而不是为整个EMV种群平均提供单个或几个参数。因此，“与当前单参数技术相关的许多问题和缺点可以通过最近引入的NTA方法来克服，该方法可以对流体样品中的纳米颗粒(NPs)进行直接和实时的可视化以及定量评估”。

在对NTA的类似评估中，Zheng等人(2012)使用NTA监测Rab27相关的外泌体途径，表明它可以用于监测表达针对Rab27a的抑制RNA的MDA-MB-231乳腺癌细胞的外泌体分泌的抑制，Rab27a是外泌体途径的已知成分。他们的结论是，他们的数据表明“纳米颗粒跟踪分析可以有效而快速地用于监测外泌体分泌的破坏”。

新的商业测试

由于人们对这一领域的兴趣日益浓厚，最近开发了许多新的试剂和技术，用于分离、纯化，有时还用于分析外泌体或其内容，并已商业化;其中一些概述如下:

• Exomir™使用另一种方法，其中样品通过注射器过滤器捕获外泌体和较大的膜结合颗粒，然后用RNA提取试剂冲洗，裂解捕获的颗粒，以便随后通过qPCR进行分析。
• Exotest™是一种专有的夹心ELISA试剂盒，用于捕获和定量血浆中的外泌体，基于清洁蛋白(CD63和rabb -5b)和肿瘤相关标志物caveolin-1 (Logozzi 2009)的表达，用于检测黑色素瘤患者血浆中的外泌体，作为癌症筛查和随访的潜在工具。
• 基于Balaj等人(2011)的研究，外泌体诊断公司正在开发一些分子诊断方法，利用肿瘤特异性生物标志物的结合试剂库，从癌症患者身上分离出外泌体，然后通过更传统的夹心免疫测定技术进行后续分析。
• 利用Delcayre等人(2005)开发的技术，Anosys公司采用了一种称为外泌体显示的新方法，可以操纵外泌体的组成，并使外泌体具有新的理想特性。
• ExoQuick™是一种基于聚合物的专有外泌体沉淀试剂，可从血浆和其他体液中的外泌体中一步提取microRNA和蛋白质生物标志物，随后通过qPCR进行分析。有趣的是，NTA被用于确认该技术的外泌体沉淀(Systembio技术手册2011)。
• Caris生命科学公司也正在开发一种基于血液的诊断技术，称为Carisome™，它可以捕获和表征包括外泌体在内的循环微囊泡，该技术基于Skog等人(2008年)最初开展的工作。
• Exosome Sciences (2011)， Inc.开发了一种96孔的检测方法，使研究人员能够使用针对外泌体的酶联凝集素特异性检测(ELLSA)分离血液和其他液体中的外泌体，通过检测与外泌体上特定生物标志物相关的抗体等分子，可以对其进行分析。
• Life Technologies, Inc.最近描述了一种新的试剂，用于从复杂介质和生物流体中分离外泌体，用于其RNA标记识别系统Ion Torrent (Magdeleno, 2012)。该试剂最近被Vlassov (2012a)推广为“完整的外泌体工作流程解决方案:使用Ion Torrent个人基因组机从分离到鉴定RNA标记”，使用NTA证明他们的试剂在分离外泌体时与超离心一样有效。同样，Zeringer(2012)描述了使用该试剂对来自不同样品类型的外泌体进行浓缩，以进行下游分析。
• 最近，101Bio公司生产了PureExo®外泌体分离试剂盒(2013)，该试剂盒声称在2小时内从血清或血浆中分离完整外泌体的效率为95%，无需超离心。
• 另一种试剂盒Exo-spin™被宣传为适用于从各种生物液体(包括血浆/血清、细胞培养基、尿液和唾液)中制备纯的、功能性的外泌体。它还声称比超离心更快，比竞争对手的试剂盒更有效(Exo-Spin, 2013)。他们再次使用NTA来确认产品的质量。
• Norgen的尿液外泌体RNA分离试剂盒也被宣传为从尿液和组织培养基中浓缩和分离外泌体RNA的一体化系统。尿液的分离和纯化是基于自旋柱色谱法，使用Norgen的专有树脂作为分离基质，然后裂解外泌体以释放RNA，然后将其与Norgen的树脂(BIND)结合以进行后续分析
• 最后，HansaBioMed(2013)为外泌体研究提供了包括免疫珠在内的产品。他们还出售经nta分析的外泌体标准品，声称其“纯化的冻干外泌体来自不同的生物来源，包括细胞培养上清、人类血浆和尿液样本中的外泌体……和“....”分离是通过超离心和微滤程序的组合......外泌体随后被量化，并通过NTA与NanoSight验证总蛋白质含量和颗粒数。冻干对外泌体蛋白稳定性的影响与其他储存方法(如在-20°C下储存新鲜外泌体并在4°C下确认其稳定性超过12个月)相当。”

所有这些产品都是外泌体分离的替代品，但由于沉淀步骤可能将外泌体沉淀在许多杂质中，因此可能缺乏特异性。

此外，还应进一步认识到，上述所有测试都侧重于从复杂的生物流体(如血液、尿液等)中分离外泌体结构，以便随后通过更常规的机制(ELISA、qPCR等)进行分析。因此，它们可以被认为是批量纯化/分离方案，没有机会单独表征，表型和枚举外泌体本身。如下图所示，这种能力将为外泌体在诊断中的开发提供显著的优势，并且由NTA技术提供。

NTA作为MV表征方法的出现和评估

继DLS应用于测量微粒的早期工作之后(Harrison 2008;Harrison等人(2009年)，Gardiner等人(2009年和2010年)开始使用NTA对细胞微粒和外泌体进行可视化、大小和浓度测量。其他研究小组在讨论血液中微粒分析的分析前和分析问题(Yuana等人(2011))以及使用光散射方法测量微粒大小和浓度(Gabriel和Giordano, 2010)时开始评估NTA。

随后，Dragovic等人(2011)使用NTA将他们的工作扩展到细胞囊泡的大小和表型，而Sokolova等人(2011)使用NTA和SEM描述了源自人类细胞的外体的表征。进一步的研究专门针对NTA用于(循环)微粒的分析和浓度测量(Gardiner, 2011);细胞外泌体和纳米囊泡分泌的分析(Powis et al. 2011);体内来源的人细胞外囊泡分析(Taylor, 2011)和免疫细胞微囊泡和外泌体分泌监测(Soo et al.(2012))。Cicek Gercel-Taylor等人(2012)后来将NTA用于卵巢癌患者循环细胞源性囊泡的分析。

在研究其他方法时，还比较了NTA在使用蛋白质微阵列对人血浆中外泌体进行定量和分析(Jørgensen等人(2012))以及在正常尿液中外泌体的分离、浓度测量和表征(Dimuccio等人(2012))。

Vlassov和他的同事们回顾了外泌体的主题，概述了它们的组成、生物学功能以及诊断和治疗潜力的现有知识，并强调了以下几点:i)外泌体是含有核酸和蛋白质的微囊泡，由所有细胞分泌;Ii)外泌体大量存在于包括血液、唾液、尿液在内的所有体液中;iii)外泌体最有趣的作用是细胞间通讯。他们还描述了外泌体的组成、功能和途径，并讨论了用于潜在诊断和治疗应用的外泌体(Vlassov et al. 2012b)。他们给出了液体样品中外泌体的NTA分析的几个例子，通过蔗糖梯度显示出越来越轻的组分，正如这些制剂中更明确的颗粒大小所显示的那样，从而证明了与EM和DLS等更传统的工业标准方法相比，NTA可以很容易地用于快速提供有关此类结构的大小和浓度信息。

Tatischeff(2012)报道了通过NTA、低温电子显微镜和拉曼镊显微光谱快速表征细胞来源的细胞外微泡的方法，而Arigi等人(2012)使用NTA进行了人类子宫内膜癌细胞来源的细胞外微泡的蛋白质组学分析和表征。Huang等人(2012)描述了使用超滤方法从临床样本中分离肿瘤相关外泌体。

在广泛的研究中，NTA越来越多地被常规用于微粒和外泌体的分析。以下重点介绍了NTA在确定所研究的微泡结构的物理化学性质方面发挥核心作用的一些研究。

Cantaluppi等人(2013)报告了NTA数据(以及FACS、western blot、生物分析仪和RT-PCR)在他们关于人胰岛来源的微囊泡(MVs)的分离、表征和促血管生成活性的报告中，而Katsuda等人(2013)在他们关于受阿尔茨海默病(AD)影响的大脑中β-淀粉样肽(Aβ)积累的研究中表明，人脂肪组织来源的间质干细胞分泌功能性的neprilysin结合的外泌体。在Neprilysin (NEP)是最重要的a β降解酶的前提下，他们利用NTA和TEM探索了病毒介导的NEP基因传递，以确认纯化的adsc# 4衍生的外泌体在175 nm处的大小。收获的外泌体分别用Bradford法和NTA法测定蛋白质含量和颗粒数。

Hajj等人(2013)报道了协同伴侣应激诱导蛋白1 (co-chaperone stress-inducible protein 1, STI1)的某些细胞通过异质细胞外囊泡群的非常规分泌。STI1缺乏信号肽，药理学方法指出它不遵循经典的分泌机制。在他们的研究中，他们使用NTA专门测量ev数量的浓度，他们发现星形胶质细胞分泌来自含有STI1的MVBs的多种ev，并表明ev与神经元表面成分之间的相互作用增强了STI1 - prpc信号传导。

Hutcheson等人(2013)先前已经证明巨噬细胞来源的基质囊泡(MVs)与动脉粥样硬化斑块纤维帽内微钙化的形成相关，他们发现，在脂筏结构域巨噬细胞来源的基质囊泡被调控释放期间，易损斑块中微钙化的形成发挥了作用。NTA用于表征RAW264.7巨噬细胞系在促炎细胞因子TNF-a (@ 20 ng/mL)处理后mv的释放。脂筏结构域通过共聚焦显微镜用霍乱毒素为基础的GM1神经节苷脂染色鉴定。使用NTA的动力学研究表明，未经处理的RAW264.7细胞在24小时内以恒定的速率释放MV(平均R2=0.95)。用TNF-a处理RAW264.7细胞导致MV分泌率增加1.8倍，持续6小时。在初始速率增加后，MV释放进一步被完全抑制，直至24小时。

在体外实验中，NTA还被用于确定胎牛血清外泌体RNA的贡献(Shelke等人(2013))，并协助研究大鼠尿液中细胞外囊泡的microRNA含量，以区分健康与多囊肾病(Moggio等人(2013))。Antone等人(2013)的研究表明，吸烟可诱导易感受试者的中性粒细胞/单核细胞微泡增加。

为了寻找非侵入性疾病生物标志物的新来源，并表明肝细胞释放的细胞外囊泡也携带RNA, Royo等人(2013)最近证明，这些囊泡可能参与星状细胞的激活，可能成为肝毒性标志物的非侵入性鉴定的新来源。NTA用于表征两种非肿瘤肝模型中释放的细胞外囊泡:大鼠肝细胞原代培养和小鼠胎儿肝祖细胞系。

Raposo和Stoorvogel(2013)最近对细胞外囊泡、外泌体、微囊泡和相关结构进行了一篇出色而全面的综述，特别关注了EV的特征以及目前提出的EV形成、靶向和功能机制，认识到我们对EV形成的分子机制的认识不足，以及缺乏干扰货物包装或囊泡释放的方法。然而，仍然阻碍了它们在体内的生理相关性的鉴定。

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