10个小贴士定量免疫组织化学染色

科学界正在向发展中日益复杂的投入很大的精力在体外分析促进高分辨率成像。虽然这是可能的在活的有机体内、高度专业化培训和昂贵的设备是必需的。

在体外高分辨率成像可以直接观察到不同的细胞的作用在疾病的发作或药物反应。这是成为一个特别强大的工具,现在的研究表明,细胞微环境可以极大地影响疾病如癌症的发展¹和治疗的成功治疗,如化疗。²

一般来说,强大的表型信息可以从细胞中提取的图像。此外,人们可能会想获得基因型数据关联表现型和基因型。为此,免疫组织化学(包含IHC)通常被选择的工具。

包含IHC由固定细胞的荧光抗体染色法检测生物标志物的存在。注意,包含IHC使用固定细胞,因此限制在一个固定的时间点学习样本。或者,可以使用live-fluorescent染色可以强大,但与此同时,染色可以影响细胞的生存能力和行为未知的方式。

和包含IHC是一样强大,它也经常不清楚如何从生成的图像中提取信息。

这里我们暴露10建议应该帮助你设计的策略分析包含IHC图像。

这些一般建议旨在帮助你设计你的分析,并且可以应用于图像分析软件的选择。

垃圾,垃圾

只有你能做一个图像后处理。

如果图像质量不好或者实验设计没有准备充分,分析将不可避免地是有缺陷的。

第一个建议是高度选择性与您选择的图像进行分析,因为你可能会浪费很多时间优化分析,是注定要失败的,因为质量差的图像。

不要等待获取图像从众多的实验来完善你的分析

一旦你获得包含IHC图像从第一组实验,看看他们,这样你就可以快速识别任何潜在的问题与你的染色,并确认您当前包含IHC协议使您能够回答这个问题的兴趣。

这样可以确保你可以很快适应你的协议之前,下一组实验和最小化风险的把时间和精力浪费在染色样品不足。

质量控制是至关重要的

与包含IHC你在绝对不会回答你的问题。

换句话说,染色可以受到许多因素在固有的实验过程或操作符。这意味着正确回答科学问题的唯一方法与包含IHC比较结果控制样本,经历了同样的过程。

您还需要使用控制来证明你的污点确实有效。例如,您需要使用同形像控制第一和第二抗体,检查信号不是引起的非特异性抗体和细胞之间的相互作用。正面和负面的控制是必要的验证的特异性染色。

具体来说,你应该使用细胞不表达感兴趣的生物标记,证明你的生物标志物并不是发现在这些消极的控制。

另一方面,你还应该染色细胞你知道应该表达标记,证明你可以看到积极的控制的生物标志物。

包含IHC可以帮你帮你检测生物标志物的存在

确定感兴趣的生物标志物表达你的样本是一个基本的问题,可以与包含IHC回答。

生物标志物是”表示“如果你可以检测颜色像素对应的荧光标记你用于包含IHC协议。

例如,如果您使用488 nm共轭抗体,绿色像素的存在将向您展示生物标志物的表达。不用说,你要确保没有其他样品是绿色的,否则你无法区分信号特定于您的生物标志物。

值得注意的是,你可以经常发现背景荧光不是特定于您的生物标志物,这可以量化你的消极控制样品不应该表达的生物标志物。

您需要决定是否足够很小,你可以忽略它,还是重要的是足够的,你应该减去这个背景荧光信号,或确定一个阈值以下,你考虑你的非特异性荧光。

确保noise-to-signal比例很小,否则你可能只是观察噪音!

标记的数量改变了A和B之间的条件吗?

一旦你知道你的标记表示样本,你可以开始探索其相对表达在不同的条件。

在这种情况下,你有几个选择:你可以比较强度,或染色样品之间的程度。

换句话说,比较信号是否的直方图:

• 有更多的像素表达任何数量的标记,或者:
• 更高的信号强度是表示,相同数量的像素更高的强度。

变化都可以指向一个更高的表达你的生物标志物在整个样本。

做更多的细胞生物标志物表达?

到目前为止,我们已经讨论了分析像素在整个图像。然而,更可以通过研究单个细胞中提取有意义的信息。

如果你看到一个全球变化信号在整个图像,它意味着更多的细胞表达生物标志物或相同数量的细胞表达更多的吗?

为了回答这些问题,部分细胞的边缘,这样你就可以考虑他们个人的基础上。

一旦完成,您可以量化多少细胞包含感兴趣的像素的颜色:细胞重叠信号可以被视为表达生物标志物。

再一次,这是非常重要的决定背景阈值以下,你考虑信号只是噪音,使用你的消极的控制。

你会发现硝唑信号细胞可能比平均信号更加信息化在整个图像中的细胞群,细胞可以非常异构。

更多的生物标志物表达细胞吗?

为了解决细胞异质性,你也可以量化每个细胞信号的强度,而不仅仅是它的存在。这比回答更多的细胞是否表达了不同的生物标志物:这是测试细胞是否表达或多或少的信号。

再次,你需要部分细胞和量化每个细胞的总强度信号。这可能揭示重要的特定细胞的信息在你的样品是敏感而其他人可能不会改变条件。

在细胞中表达吗?

您可能还想确定细胞内生物标记的位置。例如,一些细胞内蛋白质可能从细胞核转移到细胞的细胞质中。

为此,硝唑感兴趣的生物标志物与细胞核的染色,可与DAPI染色。

通过量化的百分比的变化重叠细胞核染色和生物标记染色,您可以测试感兴趣的蛋白质是否改变了细胞内定位,从细胞核进入细胞质。

建立生物标志物分布

表面受体是至关重要的许多生物过程和通常包含IHC染色。除了测试他们的存在,它可以丰富看染色分布在细胞膜,在某些情况下,观察它是否变化。

要做到这一点,您可以计算一个强度剖面在细胞的周长,并观察是否受体的分布变化之间的条件。这可能是特别相关的表面受体参与细胞之间的紧密连接。

与微环境

分析不同的颜色可以改善你的分析。例如,荧光标记细胞可以可视化的颜色不同于感兴趣的生物标志物。

这使特定的细胞类型之间的空间关系的研究和感兴趣的生物标志物。

你可以确定不同的细胞类型之间的身体接触或接近生物标志物的表达变化在一个给定的细胞。这将打开大门微环境效应的研究在给定的生物标志物的表达可能相当强大的和相关的,特别是在复杂的背景下发展在体外模型包含许多类型的细胞。

引用

1. 乔伊斯,j . &波拉德,j . w .微环境调节转移。Nat。启癌症9,239 - 52 (2009)。
2. 休斯,r . et al .血管周的M2巨噬细胞促进肿瘤化疗后复发。癌症Res。(2015)。doi: 10.1158 / 0008 - 5472. - 14 - 3587