成功CRISPRi的5个关键步骤

基因组编辑技术正在彻底改变生命科学，而CRISPR技术是定期更新其多功能平台的关键参与者。在选定的细菌和古生菌中，CRISPR (C光泽R鲁西平原我nterspaced年代长的矮PalindromicRepeats)和CRISPR相关系统(Cas)通过碱基对形成rna靶向并切割外源DNA元件，以授予适应性免疫。该机制在实验室中实验使用(和优化)在宿主独立的环境中，以目标和编辑特定的遗传密码或重编程基因组来操纵细胞。虽然不同的CRISPR系统存在于各种生物中，但最简单的版本是II型CRISPR，由一个Cas9催化酶和两个rna组成;成熟的CRISPR RNA (crRNA)和反式作用RNA (tracrRNA)。研究人员结合双组分原生RNA系统，在实验室中设计了嵌合单导RNA (sgRNA)，提高了实验效果。2012年，一个科学家团队通过整合核酸酶缺陷、突变的Cas9或“死亡的Cas9”(dCas9)，对CRISPR系统进行了进一步的变异，以重新利用该系统，并在不切割/编辑的情况下调节DNA序列进行改变和抑制，从而产生CRISPR干扰(CRISPRi)。

CRISPRi同化催化死亡的Cas9，缺乏内切酶活性，与引导RNA (gRNA)共表达。然后dCas9:sgRNA机制形成DNA识别复合体，该复合体可以特异性地干扰转录延伸或与RNA聚合酶(RNAP)位点结合以阻止转录启动，从而全面阻断信使RNA (mRNAs)的产生。RNA嵌合体和目标DNA之间的碱基对形成由位于目标序列3 '端的短DNA序列实现，称为“原间隔相邻基序”(PAM)(图1)。失活的dCas9突变体是通过ruvc样(D10A)和HNH核酸酶(H840A)结构域的两个点突变实现的。dCas9:sgRNA机制可以与额外的效应域融合，用于有效的基因干扰(CRISPRi)或基因激活(CRISPRa)。

CRISPRi的主要亮点(包括优点和缺点)

• 该机制由一个非活性的dCas9蛋白定义，用于靶向基因组调控。
• dCas9: sgRNA机制允许通过sgRNA的20个碱基对区域形成互补碱基对，以靶向感兴趣的DNA序列上的特定基因组位点。
• CRISPRi可以通过多个rna调控多个基因而不产生脱靶效应。
• 这种沉默是可诱导和可逆的，在细菌中具有高度特异性。
• 在哺乳动物细胞中，转录抑制是相对可变和适度的。
• 相关外源DNA上必需的PAM序列可能限制结合位点。

图1:重新利用CRISPRi系统来调节基因组。dCas9-sgRNA复合物与目标DNA区域的非模板链形成碱基对，用于转录干扰(延伸或起始)。原图片改编自Addgene．资料来源:Lei S Qi(斯坦福大学)

CRISPRi机制提供了一种高效、可逆和特异性的基因组调控平台，用于转录控制，而不改变目标DNA序列。以下指南包括使用派生的dCas9实现CRISPRi的关键步骤酿脓链球菌．

计划CRISPRi实验-实验设计

一旦你决定了所需的基因操作，使用以下变量来设计哺乳动物细胞和细菌生物中的CRISPRi实验框架。

• 选择Cas9的种，设计死Cas9 (dCas9)。
• 设计sgRNA序列用于特定位点的碱基配对，使脱靶效应最小化。
• 选择Cas9和sgRNA的表达系统。
• 选择一个可选择的标记物(要量化的药物或荧光团)
• 选择交付方式。
• 选择检测方式。

选择CRISPRi的目标位点

dCas9-sgRNA复合物与目标DNA的结合特异性依赖于NGG PAM基序。对于基因组内灵活的靶点特异性选择，CRISPRi靶向是通过sgRNA互补的20碱基对(bp)区域和目标DNA序列之间直接的Watson Crick碱基配对，通过必需的3-nt PAM序列实现。

• 其他来自不同物种的Cas蛋白及其对应的PAM序列可在Addgene.org上获得。
• 嵌合sgRNA包含一个20个核苷酸(nt)碱基配对区域2)一个dCas9处理发夹(42 nt)和3)一个链球菌衍生终结者(40-nt)来模拟天然RNA复合物。
• 设计20-nt sgRNA序列，以目标基因的启动子/增强子区域为目标，或以目标基因5 '端编码序列的开头为目标。
• 使用Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)检查sgRNA在基因组中结合的特异性。为了排除额外的结合位点和脱靶效应，BLAST在感兴趣的基因组中搜索14-nt特异性区域，其中包括sgRNA的12-nt“种子区域”和3-nt PAM区域的2-nt。
• 对于大量短核苷酸sgrna的基因组图谱，使用SeqMap计算脱靶效应。只使用没有可预测脱靶的sgrna。
• 附加dCas9句柄和链球菌利用Quickfold或RNAfold模拟算法预测嵌合sgRNA二级结构。
• 确认sgRNA序列不包含限制性内切酶位点序列(例如细菌sgRNA的EcoRI、Bg1II和BamHI;BstXI和XhoI(用于人类sgRNAs))，然后将模板克隆到表达载体中。
• 可选步骤:调节抑制效率，在sgRNA碱基配对区域引入单个或多个错配。

选择Cas9和sgRNA的表达系统

在哺乳动物细胞中，催化死亡的Cas9 (dCas9)可以融合到转录抑制因子域，如KRAB (Krüppel associated box)，以增强抑制作用。相反，激活基因表达使用激活域，如VP16或VP64，与哺乳动物细胞中的dCas9配对。为了使CRISPRi功能化，你需要通过表达载体在目标细胞中表达的dCas9和gRNA模板。

• 为sgRNA和dCas9选择合适的表达载体。在哺乳动物细胞中使用的主要表达系统和变体是网上．
• 用于哺乳动物系统和细菌中的CRISPRi质粒或载体表达系统浏览可用的结构．
• 以下由Stanley Qi实验室重新放置的质粒，推荐用于细菌生物和哺乳动物细胞中dCas9和sgRNA的表达。
• 如果你使用的质粒不共表达gRNA和dCas9，使用单独的表达载体来抑制特定的感兴趣位点，如上所述。
• 当克隆嵌合sgRNAs到一个小表达载体(5 kb)时，使用寡聚PCR和消化/连接方法，以避免iPCR可能引入的PCR错误。
• 要将多个sgrna克隆到单个表达向量，请使用倡导装配方法或金门克隆程序复用CRISPRi。
• 这些载体可以转化为大肠杆菌的克隆菌株，例如市售的One Shot Top10化学活性菌株大肠杆菌细胞，然后培养到足够数量的质粒纯化。
• 表达系统应包括选择标记(如新霉素)或报告基因(如GFP)，以在传递到靶细胞后验证基因修饰。
• sgRNA表达的阴性对照是一个没有20-nt碱基配对区域的表达载体。dCas9表达的阴性对照是相同的表达向量，但没有dCas9编码序列。

下发dCas9和sgRNA

我使用来自LI-COR的IRDye偶联抗体，可以通过他们的奥德赛®成像系统检测。这些染料可以在700nm或800nm通道中检测到。

• 对于细菌系统中的靶向基因表达:将sgRNA载体与诱导的dCas9表达载体(例如#44249)共同转化为所需的sgRNA载体大肠杆菌菌株(如MG1655)。
• 对于哺乳动物细胞(例如HEK 293细胞-人胚胎肾细胞系)中的靶向基因抑制，在转染前将细胞系在补充的生长培养基中培养。
• 使用市售的DNA转染试剂转染哺乳动物细胞，遵循制造商的协议。
• 每个培养细胞均转染良好的dCas9表达质粒和sgRNA表达质粒。
• 对于哺乳动物细胞，在转染72小时后测量基因表达。

设计功能验证分析

一旦gRNA和dCas9成功地传递到目标细胞，就是时候验证预期的CRISPRi调控或基因组抑制水平了。

• 如果目标基因与荧光蛋白或LacZ融合;使用流式细胞仪或β-半乳糖苷酶活性测定作为功能测定来测量对蛋白质表达的影响。
• 测量内源性基因转录抑制的功能测定也可以包括qRT-PCR或全基因组NET-Seq技术。
• 例如，Net-Seq可以通过dCas9: sgRNA机制的干扰指示被破坏的确切基因组位点。
• 由于CRISPRi的功效可能因细胞类型和生长条件而异，因此在相同细胞类型和相似生长条件下进行所有测试。
• 这里列出的概述指南描述了CRISPRi (sgRNA和dCas9表达抑制感兴趣的靶基因)在大肠杆菌(如MG1655株)或人类细胞(如HEK 293细胞)。
• 在之前的研究中，dCas9和sgrna在细菌中促进了强大的沉默和基因抑制，效率更高(99-99.5%)，而在人类细胞中效率中等(~50-60%)，并有可能进行优化。

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