成功使用CRISPR-Cas9的9大秘诀

CRISPR-Cas9是一种革命性的基因组和表观基因组编辑资源，迅速取代了旧的基因组编辑工具。因为这是一项新技术，许多科学家和研究人员都不太了解它的复杂性。他们想要提高他们对这个新奇工具的认识，这个工具正在各个实验室引起轰动。如果你属于这一类，或者只是想学习一些优化基于crispr的实验的技巧和技巧，那么本指南就是为你准备的。

细胞根本不喜欢双链断裂

很简单，CRISPR-Cas9 DNA编辑生成DNA双链断裂(DSB)，由与其基因组目标互补的RNA分子引导。然而，dsb具有极强的细胞毒性，如果不修复可导致细胞死亡。细胞修复DSB一般有两种方式:非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。^1、2NHEJ发生在DSB的两个被切割的末端被栓回一起时，通常会导致DNA两条链上的随机插入或删除(indels)。因此，很难预测由此产生的NHEJ修复的确切顺序。相反，HDR是一种随机得多的修复机制，其中另一条染色体上与DSB的同源区域被用作修复模板。由此产生的序列将与另一条染色体的序列完全相同。在细胞中，这两种机制都用于确保基因组的完整性，但CRISPR-Cas9使用这些方法来生成感兴趣的基因编辑。¹

Cas9编辑的RNA组分

Cas9需要两个RNA成分才能正常工作:位于3 '端的结构成分(tracrRNA)和位于5 '端的引导Cas9切割到其基因组靶标(crRNA)的第二个成分。它们可以结合形成嵌合单导RNA (sgRNA)。^{1 2 3}本节将重点介绍crRNA或sgRNA中指导Cas9切割的部分的设计。

一般来说，至少有20个crRNA核苷酸必须与目标DNA链互补，在目标链的3 '端(也是crRNA的3 '端)具有专属的NGG Protospacer毗邻Motif (PAM)序列。crRNA应该与目标序列互补。然而，互补crRNA与靶DNA之间存在一定程度的耐受性。^2、3事实上，crRNA可以与3或4个碱基错配的目标位点结合，特别是在远离PAM的序列中。重要的是，NGG不是20个核苷酸同源的一部分。靶区GC含量应达到50%，过高或过低的GC含量都会破坏crRNA的靶向作用一旦gRNA与目标序列结合，在PAM的第三和第四个核苷酸之间(即20个碱基目标序列的17和18碱基之间，从5 '到3 '方向)产生DSB。^2、3从这里开始，CRISPR-Cas9切割事件已经发生，细胞将尝试使用NHEJ或HDR修复途径修复DSB。

基因敲除和缺失

敲除基因可以说是使用CRISPR-Cas9最简单的基因编辑。简单地生成gRNA，添加Cas9，然后切割!然而，在描述基因敲除时，要确保所得到的indel不是3的倍数，因为这被认为是“框内”缺失或插入，基因仍然可以正常工作。

由于CRISPR-Cas9编辑的健壮性，可以很容易地产生删除。Cas9只能结合一个gRNA，但不同的Cas9分子可以结合不同的gRNA并靶向不同的序列。正因为如此，在CRISPR-Cas9实验中很容易形成缺失。只需从所需的删除中生成上游和下游的grna，并将两者都包含在实验中。基因倒置和染色体重新定位也可能使用这种策略。

产生单核苷酸多态性

为了生成这些类型的编辑，我们利用了细胞固有的HDR机制。该过程涉及Cas9蛋白与gRNA以及供体DNA模板。当产生SNP或条件等位基因时，单链DNA寡核苷酸将足够作为DNA模板供体。为了指导正确的DNA修复，50-80bp的同源臂应该包含在DNA寡核苷酸中。²标准的ssDNA合成的最大长度通常是200bp，但是如果需要更大的敲入，有些公司可以生成高达1.5kb的ssDNA。理想情况下，切割位点(PAM的第三和第四个碱基之间)是所需SNP的位置，但如果不是，切割位点应该距离待编辑的碱基不超过10bp。在供体DNA模板中，包含一定程度的方差以防止Cas9切割先前编辑的DNA是极其重要的，因为只要gRNA能够识别互补DNA, Cas9就会继续产生双链断裂。^2、3因此，重要的是尝试并将期望的SNP定位在尽可能靠近PAM的位置，以1)破坏PAM周围的碱基以防止gRNA退火并使Cas9裂解;2)最大化期望编辑的同源臂。

大型建筑敲入

对于较大的编辑，如基因插入或特定位点上的卡带插入，质粒DNA可以用作供体模板。在这种情况下，同源臂的长度应该至少为800bp，可能超过2kb。线性双链DNA，如PCR片段，也可以用作修复模板，但你应该记住，线性片段可以随机整合到某些生物的基因组中。使用CRISPR-Cas9编辑的大型敲除效率极低。在这些情况下，拥有大的样本量可能是有用的，因为只有一两个细胞可能最终获得所需的敲入。此外，必须去除敲入结构中潜在的Cas9切割位点，因为只要目标序列存在，gRNA-Cas9复合体就会继续生成dsb。对于较大的敲入序列，包括抗生素抗性标记、荧光标记或一些其他基因标记来识别可能已将该结构整合到其基因组中的细胞可能是有用的。

CRISPR编辑可以一次生成多个编辑

所有CRISPR-Cas9事件的潜在机制是，它在RNA分子的引导下在一个位点上切割DNA，然后使用原生细胞机制生成感兴趣的编辑。在一项CRISPR实验中，有可能对基因进行一系列有用的编辑。例如，在一个细胞或胚胎中，Cas9 DSB有可能通过NHEJ修复，产生可能导致基因敲除的indels。而在另一个细胞中，DSB可以通过HDR进行修复，使用DNA供体作为修复模板，在感兴趣的基因上产生SNP。在某些情况下，双等位基因编辑可以在两条染色体得到相同的敲入或基因破坏时产生，尽管这种情况很少见。

开始之前有基因分型策略吗

信不信由你，生成crispr编辑事件非常容易。另一方面，找出最终的基因型可能需要更多的劳动密集型。以下是一些基因分型标准方法的快速概述:

1. PCR检测:这种方法依赖于从样本的基因组DNA中扩增一个基因片段，可以很容易地用于检测缺失或插入。
2. 桑格测序:为了确定准确的序列，可以对PCR片段进行测序或克隆到质粒中，然后进行测序。对原始PCR产物进行Sanger测序的缺点是，一旦测序迹到达切割位点，就不能获得太多数据，因为有可能从两条染色体上产生不同的reads。为了辨别准确的序列，需要克隆，这是非常劳动密集型的，如果筛选许多样本，可能不适合，因为每个菌落只能克隆一条染色体的一个遗传片段。
3. Illumina下一代测序:这种方法类似于Sanger测序，但提供了更高的吞吐量，因为每个PCR片段可以产生数千个单独的读取，而且劳动成本最低。这也消除了克隆的需要，因为每个单独的读取然后被池化，为每个提交的样本提供一个大数据集。这种方法的一个问题是，只有小于400bp的短片段才能可靠地测序，如果你只表征少数样本，它可能不是一种经济有效的方法。
4. PCR产物的酶切酶解:一旦标记了indel，或者HDR在SNP中包含一个唯一的限制位点，就可以使用这种方法。简单地扩增纯化的基因组DNA片段并添加限制性内切酶。一定要检查PCR缓冲液中限制性内切酶的活性，以避免PCR纯化步骤。
5. 表型选择:这可以是抗生素抗性标记，荧光蛋白的产生，或将非原生基因引入细胞。这些是检测感兴趣基因导入的最简单方法，但迄今为止效率最低。这种类型的选择只能在引入大的敲入或基因盒时使用。

非目标效应

CRISPR并不是一个完美的基因组编辑工具。如前所述，crRNA和基因组目标序列的结合可能会发生变化，从而允许crRNA退火为脱靶序列并生成DSB。然而，在减轻CRISPR-Cas9编辑事件可能产生的脱靶效应方面已经取得了进展。首先，基因组测序文库和在线工具可以帮助设计grna，减少你试图编辑的基因组中的脱靶位点。我经常使用的gRNA设计工具是CRISPOR server (http://crispor。Tefor.net/)用于评估目标活动以及潜在的偏离目标的网站。或者，CCTop服务器(https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/is)用于确定目标站点，而CasOFFinder服务器(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)用于查找潜在的偏离目标。大多数模式生物的基因组已经完全测序，因此gRNA的发育可以很容易地简化以寻找潜在的脱靶位点。随着脱靶效应分析越来越主流，我们对选择哪一种grna的理解也越来越清晰。

另一种减少脱靶效应的方法是修改Cas9蛋白，使其减少切割。Cas9的两种主要变体已经被开发出来，其中蛋白质的DNA结合能力大大降低这里的逻辑是，如果Cas9蛋白不能与DNA物理结合，脱靶编辑就会更少，这是正确的。这些修改过的Cas9s的收益是crRNA不再与目标序列有任何不匹配。DNA结合减少的Cas9变体可以以Cas9- hf1, eCas9和Alt-R Cas9的名称购买。

Cas9的最后一个减少脱靶效应的变体是仅仅划伤DNA而不是产生DSB的变体。²切割DNA可以防止NHEJ的发生，并产生可以使用HDR修复的断裂。这为在缺口处提供供体DNA模板提供了一个机会窗口，以将感兴趣的编辑整合到基因组中。缺口Cas9的脱靶效应几乎完全缓解，因为不产生dsb，任何脱靶位点将通过修复缺口最小化。然而，通过Cas9s缺口，基因敲除非常罕见，通过HDR修复也减少了，因为细胞修复DNA缺口比为HDR投入能量要容易得多。

现代CRISPR适应性

许多研究小组正在利用催化死亡形式的Cas9 (dCas9)来产生表观遗传编辑。^1、4CRISPR-Cas9的原理保持不变:使用gRNA将Cas9靶向到基因组上的特定区域，唯一的变化是Cas9的活性残基(一个天冬氨酸和一个组氨酸)被丙氨酸取代，使其具有催化活性。研究小组已经使用dCas9来调节基因表达，当转录激活物或抑制物与之融合。⁴dCas9也被用于组蛋白修饰或DNA甲基化方面的表观遗传修饰。⁴胞苷脱氨酶也可以与dCas9融合，在不产生DSB的情况下产生位点特异性碱基替换。绿色荧光蛋白可以融合到dCas9上，以跟踪和成像染色体上的特定位点。最后，还有一些Cas9的同源蛋白，如Cpf1 (Cas12a)也能在基因组DNA中产生dsb，除了产生交错的末端。Cpf1还识别了一个不同的PAM序列NTTT，它扩展了基因组中的编辑能力。⁵此外，Cas13可以编辑RNA而不是DNA，这可能有利于进一步的治疗发展，因为没有对DNA进行编辑。⁶

参考文献

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