如何选择合适的Western Blot检测方法
Western blotting是一种分子生物学技术，以蛋白质的大小为基础进行分离和检测。它包括十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后将蛋白质转移到膜上(硝化纤维素或聚偏二氟乙烯- PVDF)，随后用一抗和二抗检测蛋白质。可以找到详细的western blotting方案在这里．
了解检测膜上感兴趣的蛋白质的不同方法的优缺点是很重要的。在这里，我们展示了三种主要的蛋白质检测类型:1)放射性，2)酶和3)荧光(图1)。
1.放射性检测
一抗检测的最早方法之一是使用标记为放射性同位素(PMID: 388439)。碘-125是一种受欢迎的选择，它的半衰期相对较长，发射的伽马射线由低能光子组成，可以很容易地用x射线胶片检测到。它曾经是一种很流行的技术，但现在已经很少使用了。
优势:放射性检测灵敏度高，可量化。
缺点：
•相当费力——最终用户通常必须用放射性同位素标记二抗。
•相当昂贵。
•危险——需要专门的辐射安全培训、适当的个人防护装备、登记和废物处理系统。
•由于标签的放射性衰变，检测抗体的保质期有限。
建议:不要使用，更现代的方法更有效-见下文。
2.酶的检测
western blot中最常见的检测方法之一是使用与酶偶联的二抗。二抗对一抗识别的靶蛋白提供结合特异性，而附着酶则用于检测。用二抗孵育膜后，将含有特定底物的溶液涂于膜上。该酶催化底物的转化，底物严格定位于膜上二抗结合的位置。反应的结果是在膜上形成一种不溶性的彩色沉淀物，或者释放出可以被检测和量化的光子。这分别是比色法和化学发光法的基础。
一个。比色
比色法检测中最常用的两种酶是碱性磷酸酶(AP)和辣根过氧化物酶(HRP)。western blot膜与二抗结合AP或HRP孵育后，膜与含有酶底物的溶液孵育。在AP的情况下，底物是四氮唑盐，它被还原成不溶的甲醛。HRP显色底物包括二氨基联苯胺(DAB)、四甲基联苯胺(TMB)和氮基-乙基苯并噻唑磺酸(ABTS)盐。酶促反应的显色产物在western blot膜上是肉眼可见的，并且大多数在很长一段时间内是稳定的。沉淀物的数量可以量化，并与分析蛋白质的数量相对应。
优势：
•既便宜又快捷。
•生成的彩色产品是稳定的(数小时到数天)，因此可以在印迹后几周进行成像和定量。
缺点：
•难以量化-用户定义沉淀反应的持续时间，这在大多数情况下是不可逆的。测定的线性范围有限。
•灵敏度——通常需要至少纳克的被分析蛋白质才能产生可见波段，这比化学发光和荧光检测方法要差。
建议:用于抗体筛选和快速评估。
b。化学发光
HRP和AP酶也可以用合适的底物进行化学发光检测。与AP相比，HRP的使用更为普遍，因为其底物范围更广，而且使用鲁米诺或吖啶酮基化合物可提高灵敏度。与比色检测类似，将western blot膜与酶偶联的二抗一起孵育，然后将含有适当底物的溶液涂在膜上。反应的中间产物产生低能光子，可以通过将膜放置在x射线胶片上或通过电荷耦合器件(CCD)相机进行数字收集来检测。与比色法检测不同，产物不是不溶的，也不会在膜上形成可见的沉淀物。反应是短暂的，需要在最初的几分钟到几小时内检测到。市售的HRP底物具有很高的灵敏度。
优势：
•灵敏度-分析蛋白的飞图可以检测和定量使用特定的HRP底物。
•定量-使用数码相机可以识别过度曝光的膜，以确保在线性检测范围内进行测量。
缺点：
•检测的时间-光仅在基板转化为产品的过程中发射-检测需要在添加基板后立即执行。
•缺乏多路复用-如果两个被检测的蛋白质大小相似，化学发光检测不可能同时检测两种蛋白质。需要连续检测-在与针对第二个目标蛋白的抗体孵育之前，需要从膜上剥离第一个检测抗体。膜剥离需要额外的时间和控制，以确保膜上没有蛋白质损失。
建议理想的定量，当需要高灵敏度时，由于样品中分析的蛋白质水平低。
3.荧光检测
在这种方法中，检测抗体不是与酶结合，而是与荧光团结合。荧光团被特定能量的光激发，这导致光在更长的波长发射(例如;激发为680 nm，发射为694 nm)。用二抗孵育后的western blot膜用配备雪崩光电二极管(APD)或CCD相机的设备成像，以检测发射的光。与酶检测不同，不需要底物来进行检测。使用的荧光团通常在光谱的极右端(红色和红外线)，以尽量减少自身荧光。检测需要使用能够用选定光谱的光照射膜的专用设备。光源主要是led或激光。滤镜组允许荧光团的特定检测和最小化背景。使用具有非重叠发射光谱的多个荧光团允许同时检测多个检测抗体，而无需清洗和重新探测膜。
优势：
•多路复用-允许同时检测两种分子量非常相似的蛋白质，当检测抗体对与不同的荧光基团共轭时。这在比较磷酸化蛋白的丰度和总蛋白水平时特别有用。
•稳定性-经检测抗体孵育后，膜可在室温下保存数月，并可在方便的时间检测信号。
•使用简单-在检测前用二抗孵育膜后不需要额外的步骤。
缺点：
•需要专用设备进行检测和图像采集。由于标准PVDF膜具有天然的自荧光性，需要使用特殊的PVDF膜。
•灵敏度-比化学发光检测低，但线性范围宽。
建议:适用于定量和多路复用。
所有的检测方法都有其优点，但也有其局限性。为了获得最佳结果，优化western blot方案和实验条件是很重要的。良好的结果需要良好的信噪比，这通常可以通过最小化背景或改善弱/无信号，非特定频段轻松实现。
