人类干细胞如何分化为神经元

迄今为止，我们对人类生物学的大部分了解都是从啮齿动物中推断出来的。虽然这些系统是了解体内生物学的宝贵资源，但人类和啮齿动物之间存在关键差异，并且缺乏使我们能够了解人类分子和细胞生物学以及疾病的特定方面的模型。在过去的十年中，研究人员开发了使用人类多能干细胞(hPSCs)生成特定类型细胞的方法，为探索人类生物学和疾病提供了新的模型系统，并提供了新的药物筛选平台。多能干细胞有分化成任何细胞类型的能力。通过推断从发育生物学中学到的知识，现在可以在培养中产生一系列特殊的细胞类型，包括生殖细胞、心脏细胞、内皮细胞和神经细胞。

人脑包含数十亿个神经元，包括大量的细胞亚型，这些亚型产生具有无数专门功能的复杂电路。大脑皮层是大脑中最大的部分，负责认知、感知和决策等一系列关键功能。它整合了来自大脑其他部分的信号，比如下丘脑，这是一个负责调节关键稳态过程的区域，如进食、睡眠和体温。

皮质和下丘脑都位于前脑，皮质位于背侧，而下丘脑位于腹侧。因此，在体外使用hPSCs生成这些大脑区域的关键是操纵对背侧和腹侧前脑规范至关重要的细胞通路。本指南的目的是概述hPSCs向皮层神经元或下丘脑神经元分化的方案，并为首次采用这些方案的研究人员提供关键指针。如需进一步阅读和更深入的协议，我们建议您查看:(Kirwan等人，2017;Merkle等人，2015;Shi等，2012b, 2012a)。

维持多能干细胞:一切的关键

从hPSCs高效生成任何类型细胞的最重要参数是正确维护hPSC培养。虽然在小鼠胚胎成纤维细胞(喂养者)上维持hPSCs是金标准，但这种方法在技术上很麻烦。因此，我们在无饲料条件下培养细胞，在mTeSR培养基中的Geltrex底物上。解冻hPSCs时，确保它们有足够的密度，一般为每厘米2 -3万个细胞²，并在ROCK抑制剂中培养过夜，以防止细胞过度死亡。

每次不要将细胞置于ROCK抑制剂中超过24小时，因为这会产生选择事件，导致细胞系依赖于ROCK抑制剂。

阻止细胞死亡也可以选择癌基因(如p53)中不需要的突变。当细胞受到过度或过于严格的传代、培养箱维护不良(不保持湿度或错误校准的温度和CO)造成的压力或种群瓶颈时，这些突变也会累积₂)，或没有严格遵守更换媒体的常规。

介质必须每天更换，确保介质达到室温后再更换。

不要在水浴中加热培养基，因为mTeSR中存在的细胞因子FGF2对hPSC增殖至关重要，在37˚C下会迅速降解。

允许hPSCs作为菌落扩张，密切关注细胞形态。未分化的hPSCs大(10-30 μm)，核质比高。当菌落接近融合或约80%融合时，通过hPSCs。不要让hPSCs过度融合，因为它们会开始自发分化。

用1mM EDTA传代细胞。传代时，细胞在EDTA中停留时间不要超过5分钟。确保在分离细胞时轻轻移液，因为严格的移液会导致细胞过度死亡。如果细胞不容易分离，在EDTA中再培养几分钟，不断监测菌落是否分离。传代比例为1:4-1:10，取决于你的起始密度，或每厘米20,000-30,000个细胞²如果使用小区计数器。

确保保存足够的冷冻hPSCs，传代数要低(< 30传代)。还要注意，不要过度依赖某些hPSC线。有些线条更容易使用，也更有效地使神经元产生，所以值得尝试几条线条，找到最适合你的。密切注意hPSC系生长动力学的突然变化，因为这可能是不必要的突变或染色体异常的迹象。

为神经分化准备细胞

扩大你的hPSCs，使你有足够数量的细胞进行分化。我们通常使用10厘米的hPSCs进行神经分化。如果你想培养更少的细胞，你可以使用六孔板。当细胞达到80%合流，且看起来需要传代时，即可将细胞分离并镀片进行分化。我们使用TryPLE分离并解离成单细胞悬液，但其他酶如Accutase也有很好的作用。当细胞分离、洗涤并在mTeSR培养基(含Rock抑制剂)中重悬后，计数，并以每厘米100,000个细胞的密度培养²涂有凝胶或基质胶的盘子上。第二天，细胞应在70-80%汇合，并准备开始分化。如果它们没有达到这个密度，改变培养基(含Rock抑制剂的mTeSR)，并让细胞额外一天以获得合流。

如果它们的密度不够，就不要开始分化，因为你的效率会很低。

皮质分化

当细胞准备开始分化时，用PBS清洗细胞，并加入皮质分化培养基:含有TGFβ抑制剂SB431542 (10 μm)和LDN193189 (100 nM)和WNT抑制剂XAV939 (2 μm)的N2B27培养基。10厘米的盘子用20毫升，6孔的盘子用4毫升。用皮质分化培养基治疗12天，每2天更换一次培养基。

监测细胞，注意它们应该在第2天达到汇合。到第四天，它们应该变得圆润，外观均匀，有小而清晰的核。在第4-12天之间，细胞应进一步压实，没有任何可见的核，最终可能包含一些神经脊状褶皱，在那里细胞聚集形成狭窄的细长凸起结构。你可能会注意到其他不规则形状的细胞压实。总之，这些细胞形态和单分子层外观的变化表明有效的神经外胚层形成。第12天，用TryPLE将细胞分离成单细胞，1:3传代到Geltrex涂层培养皿中，传代后细胞仍100%融合。

重要的是保持高汇合度以阻止污染神经嵴衍生物的形成，它可以迅速超过神经元祖细胞。

在第12-16天之间，用20mg /mL FGF2培养N2B27细胞以促进细胞增殖，从第16天开始只培养N2B27细胞。大约在第16天，你应该注意到神经莲座的形成，这种极化的圆形结构包含大约30-100个神经祖细胞。

如果到第20天细胞还没有形成莲座状结构，很可能分化不成功，建议您重新开始分化。

第20天再次以1:3的比例传代细胞，使用TryPLE/木瓜蛋白酶混合物，再次保持细胞高度融合，以避免神经嵴污染。从第20天开始，你会注意到神经元的形成，通常是在莲座结的边缘。根据您希望进行的实验，在30-35天之间使用TryPLE/木瓜蛋白酶按所需格式进行终端电镀。培养物可以维持100天以上。

下丘脑分化

对于皮层神经元的生成，如第2节所述准备细胞，当细胞合流大于70%时开始下丘脑分化。下丘脑分化是通过首先诱导前脑神经外胚层分化进行的，就像皮层分化一样，但随后将细胞暴露于心室的Sonic Hedegehog信号激动剂。最后，抑制NOTCH信号可诱导神经发生。注意神经外胚层形成过程中发生的关键形态变化(如皮层分化中所述)。关键的区别是下丘脑祖细胞不形成神经莲座，它们的祖细胞在形态上更大更平。

在加入小分子的N2B27培养基中进行分化，如下:

• 第0天:SB431542 (10 μm)， LDN193189 (100 nM)， XAV939 (2 μm)
• 第2天:SB431542 (10 μm)， LDN193189 (100 nM)， XAV939 (2 μm)， SAG (1 μm)， Purmorphamine (1 μm)
• 第四天:SB431542 (7.5 μm)， LDN193189 (75 nM)， XAV939 (1.5 μm)， SAG (1 μm)， Purmorphamine (1 μm)
• 第六天:SB431542 (5 μm)、LDN193189 (50 nM)、XAV939 (1 μm)、SAG (1 μm)、Purmorphamine (1 μm)
• 第8天:SB431542 (2.5 μm)、LDN193189 (25 nM)、XAV939 (0.5 μm)、DAPT (5 μm)
• 第10天:DAPT (5 μm)
• 第12天:DAPT (5 μm)
• 第14天，使用TryPLE将细胞分离，并以每厘米200,000个细胞的密度重新移植到Geltrex涂层培养皿中²．

第二天更换培养基为含10ng/mL BDNF的N2B27，每隔一天更换一次培养基。

计划好您希望用细胞进行的实验，并在任何时间将细胞重新装入所需的格式(例如24孔板)，直到第35天。我们建议使用TryPLE/木瓜蛋白酶分离细胞，并以每厘米200,000个细胞的密度镀到Geltrex涂层培养皿中²对于大多数实验，但成像密度较低，如每厘米100,000个细胞²．

质量控制

在D14上重镀时，将部分细胞装入24孔板中的3孔进行免疫细胞化学染色。第15天，将部分细胞固定在4%甲醛溶液中，对前脑背侧(皮层)或前脑腹侧(下丘脑)表达的转录因子进行染色。皮质祖细胞应表达FOXG1, OTX1/2, PAX6，并应主要组织成玫瑰丛结构。大多数下丘脑祖细胞应表达NKX_2.1，除部分RAX、OTP和SIM1表达外。

在第25-30天固定剩下的细胞，染色神经元蛋白。皮层神经元应表达TBR1和CTIP2，以及泛神经元标记MAP2和β3-微管蛋白。年龄较大的皮层神经元(50-100天)应表达晚出生的皮层转录因子SATB2和CUX1。下丘脑培养应包含表达POMC的细胞(约。5-10%的细胞)以及泛神经元标志物MAP2和β3-Tubulin。较老的下丘脑培养物应表达NPY、AGRP和HCRT。

有关抗体和染色方案的详细信息，请参见(Kirwan et al.， 2017;默克尔等人)。

神经培养维持

在N2B27中加入10 ng/mL BDNF，细胞可维持100天以上。每隔一天更换一次媒体。监测介质的颜色，确保它不会变得太酸(橙黄色)。如果是这种情况，则增加介质体积以保持粉红色(中性pH值)。更换介质时要注意，确保介质温度在室温或以上，在孔中保留少量介质以防止干燥，也不要用力移液。

50天后，培养物趋于分离。避免以非常高的密度(每厘米超过200,000个细胞)进行电镀²)，以防止这种情况发生。

如果细胞出现结块或从孔的边缘脱落，每周添加10 μg/mL层粘连蛋白，以促进对塑料的粘附。我们建议在塑料上培养细胞，因为与玻璃相比，塑料的粘附性更好。如果您希望进行成像，光学级塑料碟可从Ibidi和其他供应商。我们避免在玻璃上长时间培养细胞，因为它们附着性差。

参考文献

1. 科万，P.，朱拉，M.和默克尔，F.T.(2017)。功能性人下丘脑神经元的生成与表征。咕咕叫。Protoc。神经科学81,3.33.1-3.33.24。
2. Merkle, F.T, Maroof, A.， Wataya, T.， Sasai, Y.， Studer, L.， Eggan, K.，和Schier, A.F.从人多能干细胞生成神经肽能下丘脑神经元。
3. Merkle, f.t.， Maroof, A.， Wataya, T.， Sasai, Y.， Studer, L.， Eggan, K.和Schier, A.F.(2015)。人多能干细胞产生神经肽能性下丘脑神经元。发展142号，633-643号。
4. 史，杨，柯文，P.，史密斯，J.，罗宾逊，H.P.C，和李甫西，F.J. (2012a)。人脑皮层从多能干细胞到功能性兴奋性突触的发育过程。神经科学15,477-486。
5. 史勇，柯万平，李甫西，F.J. (2012b)。人多能干细胞向大脑皮层神经元和神经网络的定向分化。Nat protocol . 7 (1836-1846)