制备用于质谱分析的非共价蛋白复合物的12个技巧

如何引导

发布日期:2018年12月7日

作者:Keiryn L. Bennett博士。

来源:Pixabay。

在过去的二十年里，随着生物化学和分析化学的进步，用质谱法制备、纯化、分析和鉴定非共价相互作用蛋白质复合物的组成成分已经变得非常简单和容易。尽管在许多实验室中，生物化学程序和基于质谱的分析仪器是相当标准和可靠的，但在这些配合物的成功制备和分析中仍有许多容易被忽视的地方。本指南结合了在执行和优化蛋白质-蛋白质相互作用组学方面超过10年的背景和经验。重点是提出和解决所有这些看似微不足道，但却极其重要的细节，这些细节可以帮助科学家生成样品进行液相色谱质谱分析(LCMS)，并识别复合物的蛋白质成分。这些提示和技巧有助于遵循参考文献1和2(1,2)中描述的协议。

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充分的准备可以最大限度地减少后续的实验问题

在开始分离和制备蛋白复合物进行质谱分析的实验之前，有一些一般的考虑因素要始终牢记:

根据纯化的数量，认真考虑在4°C的冷藏室中进行整个实验。如果这在人道上太不舒服，当然可以在标准实验室的长凳上进行实验。只要确保所有缓冲液等都在4°C的冰上冷却即可。
考虑对日常使用的缓冲区进行aliquotes，并丢弃剩余的缓冲区。这可以防止交叉污染，缓冲液变得陈旧和“不新鲜”，并最终为实验室节省资金。
在非蒸压玻璃器皿中准备缓冲液和溶液。避免使用用洗涤剂清洗过的玻璃器皿。在实验前一天检查柱子，珠子和架子。
准备并明确标记免疫印迹等分管。
通过确保无尘工作台，尽可能避免角蛋白污染，不要让刀尖和缓冲器对环境开放。
非常小心地准备所有溶液，尽量减少角蛋白的污染。
任何时候都要使用手套，如怀疑有角蛋白污染，请更换手套。总是使用过滤器尖端，以防止样品的交叉污染(高压灭菌尖端是一个污染源)。
保存和储存所有的柱流式或上清液，洗涤液等，保存所有的珠子，并保存柱。如果LCMS数据没有识别出很多蛋白质，这可能是故障排除和跟踪问题的关键。

质谱分析的临界点

影响ms生成数据质量的最大问题之一是样本污染。这可能仍然是现代质谱分析中最容易被忽视的一点。污染的来源可能是化学的或生物的，例如，从细胞中释放蛋白质复合物所必需的洗涤剂中的聚合物，使用错误类型的塑料将聚合物浸到样品中，以及其他含量高的丰富蛋白质。这些包括臭名昭著的角蛋白和天然存在的羧化酶，它们在亲和纯化程序的第一步中被共同纯化(1)。

避免角蛋白和其他蛋白质污染

永远不会忘记!角蛋白是一种蛋白质，在人类去过或居住过的任何地方都大量存在。在制备细胞裂解物和亲和纯化蛋白复合物时，在质谱样品制备过程中经常被误解的一个非常重要的一点是清洁工作。在这种情况下，清洁是指没有污垢和灰尘，而不是指在无菌条件下工作。当然，手套是必不可少的，因为要保持样品制备和所有相关区域尽可能清洁，没有污垢，灰尘和碎片。建议使用新鲜的消耗品，不要使用已经打开并被厚厚的灰尘覆盖的塑料制品。其中含有人类皮肤颗粒(如果实验室同事穿羊毛套头衫，通常是绵羊蛋白质)，这些颗粒最终会出现在实验中。简单地说，在实验的所有步骤中，通过始终使用无尘，非无菌/高压灭菌的塑料管，移液管尖端等，避免角蛋白污染。此外，在整个样品制备过程中，使用含有过滤器的移液管尖端。这消除了由于不正确使用移液管和样品吸入到移液管桶中的样品交叉污染的机会，从而污染了前一个样品的蛋白质。

尽量减少洗涤剂和聚合物污染

另一个基本原则是避免不必要的接触洗涤剂:不要在任何塑料柱/管等中培养细胞裂解物。从制备细胞裂解液中残留的洗涤剂可以覆盖塑料制品，然后被用于从亲和基质中洗脱蛋白质复合物的酸有效去除。试剂和耗材质量非常重要。避免使用不稳定的塑料制品:聚合物会从塑料中渗透到样品中。任何使用的塑料都应该是酸性的，或低pH值的，稳定的。质谱分析很容易观察到样品中的主要聚合物污染，并影响蛋白质复合物鉴定的质量。理想情况下，纯化后的蛋白质样品应尽可能不含洗涤剂。

细胞培养步骤

当涉及到含有标记的、非共价相互作用的蛋白质复合物的细胞培养实践时，请遵守您所工作的实验室的规则并遵循标准程序。对于文献2(2)中的方案，5 × 15厘米的盘子或2 × 10⁸细胞(悬浮液)，即每次蛋白复合物纯化最少50毫克总蛋白，是推荐的。理想情况下，使用新鲜的裂解液进行纯化，然而，如果不可行，将洗净的细胞颗粒在液氮中冷冻，并在-80°C保存，直到需要时。

准备细胞裂解液

当制备包含完整的，非共价相互作用的蛋白质复合物的细胞裂解液时，最小化蛋白质降解是至关重要的。否则，从细胞中亲和纯化的蛋白复合物将不能真实反映体内情况。因此，所有步骤都必须使用预冷的试剂和材料在冰上进行。这将增加复杂的产量，并减少降解任何相关蛋白质的机会。此外，为了进一步确保非共价相互作用蛋白复合物的完整性，从新鲜裂解的细胞中进行纯化是非常可取的。

净化蛋白质复合物是第一步

按照参考文献2(2)的步骤进行第一步。重要的是要新鲜制备生物素溶液，而不是使用储存的等分。生物素对紫外线的降解很敏感，随着时间的推移会失去效率。缓慢地将蛋白质裂解物应用到制备的色谱柱上，并允许裂解物通过重力流进入树脂。不需要孵育时间。在收集等份的流过用于免疫印迹和潜在的故障排除后，清洗色谱柱，然后用3 × 300 μ L新制备的2.5 mM生物素将结合蛋白洗脱到1.5 mL塑料管中。保存等分(30µL)的生物素洗脱液用于免疫印迹分析，并保存和存储剩余的珠粒和柱。

净化蛋白质复合物:第二步

在蛋白复合物亲和纯化的第二步(1)之后，用移液管去除所有上清液(即与抗血凝素(HA)琼脂糖孵育后的任何未结合的物质)。重要的是去除所有生物素化羧化酶，因为当用质谱分析样品时，这些蛋白质会导致高背景污染。当清洗任何珠子时，要防止含有洗涤剂的缓冲液重新悬浮，因为这将导致一些洗涤剂涂层墙壁，然后用酸洗脱，洗涤剂将再次主导质谱数据。将洗涤缓冲液(不含洗涤剂)从“顶部”(前一个缓冲液的水平)以圆形的方式涂抹在柱壁上，以清洗柱壁上的洗涤剂污染。在进行第二次洗涤之前，让第一次洗涤缓冲液排干。用洗涤缓冲液清洗柱尖的外部，去除任何残留的洗涤剂。这一步对于生产无聚合物的样品进行质谱分析非常重要。在这一点上，如果没有特别注意，蛋白质样品将被洗涤剂污染。洗涤剂和增塑剂是电荷清除剂。因此，在质谱分析过程中，这些成分以肽样品为代价优先电离。 Ultimately, weak signals or no peptide signals are observed. Another important tip is to not let the columns dry out. Elute the sample immediately after the last wash otherwise there is the potential that some of the protein complexes may remain irreversibly bound to the column material. Once again, avoid plastic consumables and elute directly into a glass vial. We have seen that even short-term storage in plastic results in plasticizer extraction from the consumables. With long-term storage this problem is exacerbated.

洗脱蛋白复合物

纯化的蛋白质复合物中的蛋白质可以直接从色谱柱洗脱到高性能液相色谱(HPLC)玻璃瓶(含有125 μ L 1 M三乙基碳酸氢铵(TEAB)缓冲液)中，500 μ L 100 mM甲酸存储在玻璃瓶中(最终浓度TEAB缓冲液约。200毫米)。如果酸没有从色谱柱中洗脱出来，可能需要施加少量压力来启动液体的流动。可能还需要冲洗掉所有剩余的洗脱液。一旦蛋白质被洗脱，轻轻混合以中和酸，并除去200 μ L的洗脱液。这可用于例如，运行银染色凝胶(100µL)和/或免疫印迹(2 × 50µL)。这些样品可以倒入1.5 mL的塑料管中冷冻干燥。重要的是，即使不需要，也要去除这部分洗脱液。剩余的425 μ L可以在液氮中快速冷冻或储存在-20°C的冷冻室中。请勿冻干样品!! Protein loss can occur, and it may be difficult to fully re-solubilize the proteins for the digestion step. Save all beads and columns, potentially boiling the beads after acid elution in Laemmli buffer to determine if any bait remained on the column.

消化蛋白质复合物

有大量的方案可用于减少蛋白质二硫化物键，用烷基化剂阻断游离半胱氨酸残基，以及蛋白质的溶液消化。基本上，所有这些方法都工作得很好，任何一种方法都不会出错。最重要的是，要记住，要成功地消化蛋白质，如胰蛋白酶，那么pH值应该在7.5和8.5之间。储存酸化的蛋白质可以导致蛋白质降解随着时间的推移通过酸水解(3)，因此;不建议在消化结束时加入酸来熄灭反应并停止酶的作用。这种方法的一个好处是，如果您希望将剩余的蛋白质复合物用于另一个实验，例如，用稳定同位素试剂标记用于定量质谱;样品已经处于适合贴标的条件，pH值不需要重新调整。

纯化和浓缩蛋白质复合物

在复合物中的蛋白质被消化成多肽后，下一步是浓缩并纯化这些多肽，以去除任何残留的盐和污染物，这些盐和污染物也会影响质谱数据的质量。以下内容基于参考文献(4)，但许多研究人员倾向于使用替代的商业产品或完全省略这一步，直接将摘要注入LCMS系统。尽管如此，下面给出了一些提示和技巧，可以帮助研究人员选择自制的STop and Go提取(STAGE)列。请注意，如果在方案中的任何一点，STAGE尖端中的液体在离心时没有完全流过，然后用注射器手动轻轻地推动液体通过。

为使样品酸化，将30 μL经胰蛋白酶消化的蛋白质(相当于消化物的5% (v/v))(2)移液管移至每个STAGE针尖溶液(0.4%甲酸，2%三氟乙酸(TFA))的塞子中。寻找气泡表明二氧化碳的释放和样品的酸化。必须对消化样品进行酸化，以确保与C18材料有效结合。为了将更大体积的缓冲摘要液加载到STAGE针尖上，必须添加额外体积的30% (v/v)三氟乙酸(TFA)，以确保样品的完全酸化，例如，50 μL STAGE针尖溶液+ 180 μL消化样品+ 10 μL 30% (v/v) TFA，使体积为240 μL，最终TFA浓度为~1% (v/v)。当离心STAGE尖端时，不要过快离心，因为多肽不能有效地与C18材料结合，并会在流动中丢失。再次注意，如果液体没有完全流过，用注射器手动推动。虽然使用塑料制品来制作STAGE尖端，但快速清洗和洗脱降低了提取聚合物的机会。

用50 μL STAGE尖端洗脱缓冲液(0.4%甲酸，90%乙腈)将结合的肽洗脱至透明的带v形玻璃插入的高效液相色谱小瓶中，并将每次亲和纯化的三个STAGE尖端提取液倒入同一玻璃小瓶中。这将为技术重复注射提供足够的样品，并在其中一次注射因仪器问题而丢失时提供“备份”注射。在真空浓缩器中(例如，30°C, 15分钟)从STAGE尖端洗脱的样品中去除乙腈，直到剩余约2 μL的最终体积。避免干燥到完全，因为通过吸附到玻璃表面的肽的损失增加。最后，用~8 μL 5% (v/v)甲酸对样品进行重组，使最终体积为~10 μL。根据LCMS重复分析的次数，添加8 μL 5%甲酸(v/v)的倍数。体积取决于HPLC样品回路，并可相应调整。

计算需要注射的消化蛋白复合物的数量

标记蛋白复合物的亲和纯化对于每个蛋白质都是不同的，因此，在用质谱分析胰蛋白酶消化蛋白之前，不可能确定上述建议的样本量是否适用于所有蛋白质复合物。如果质谱检测到微弱信号，研究人员可以返回到原始的、储存的消化样品，并使用更大的体积。如果质谱观察到与分析柱过载相一致的强信号，则可以重新纯化和分析较低体积的消化蛋白或稀释纯化样品。随着时间的推移，一个可以减少猜测的技巧是始终拥有一个标准蛋白质，如标记绿色荧光蛋白(GFP)。通过对标记进行免疫印迹，分析GFP的亲和纯化与感兴趣的蛋白质复合物并行，将给出表明纯化中存在的标记的相对强度的结果。例如，考虑来自亲和纯化GFP的5% (v/v)摘要。这个量通过质谱一致地达到最大信号，但不会使分析柱过载。如果在免疫印迹上，感兴趣的蛋白质的强度大约是GFP实验的一半;然后从感兴趣的蛋白质中纯化并注射两倍量的消化物(即10% v/v)。再次，提供了近似值和想法，以提供如何在实验和不同蛋白质之间标准化的想法，同时仍然最大限度地提高分析深度。 Such streamlining must be customized for each individual laboratory and workflow.

参考文献