PCR诊断为癌症和医学真菌学的进步

分子生物学领域不会有先进的现在,如果没有Kary Mullis和他的诺贝尔奖得主、聚合酶链反应(PCR) -一个重要的核酸的检测和分析技术。自1983年其介绍科学世界,PCR已成为首选方法扩增特定DNA序列(有时RNA)用于各种各样的目的。无论是用于基因定位、DNA指纹图谱,检测细菌/病毒感染,或者研究遗传病,PCR通常在许多基因的应用程序的关键。

分子生物学家,PCR的魅力在于其敏感性和特异性。现在大多数定量实时PCR检测可用比plate-based更敏感、更具体的分析,他们可以检测到一个核酸分子。[我]

例如,数字PCR (dPCR)分区一个样品到大量micro-wells,或滴,反应在每个单独进行。这提供了一组是/否结果和一个更加可靠和精确的量化。数字PCR技术是非常有用的用于检测拷贝数变异和点突变等变化。dPCR也被证明能证明高重现性,甚至跨多个实验室没有校准。(二)It overcomes the problems of background noise and relative measurements seen with qPCR (digital PCR allows absolute quantification; no known standards are needed), and enables high-throughput analysis.[iii]

从检测癌症微生物感染,现在即使是真菌感染,PCR技术已经成为分析基因表达的黄金标准。在本文中,我们将探讨如何使用PCR作为小说的诊断策略确定临床重要的酵母种类,以及检测突变可能对肺癌患者指导治疗决策。

PCR-Powered液体活检可以指导有针对性的癌症治疗

随着遗传中心主任(CGEN)在圣保罗,巴西,和医学oncogeneticist,何塞·克劳迪奥·Casali-da-Rocha博士第一手知道等待时间的差异可以使癌症治疗。与组织活检,液体活检少得多的等待时间,从而导致更短的平均时间治疗决策和早期治疗的开始时间。(四)The availability of biomarker data early in the treatment process can help oncologists review cases more efficiently and sort out the best treatment options.

但液体活检测试的最重要方面是敏感性——来自底层技术,检测和放大了DNA。根据Casali-da-Rocha,数字PCR是最实用的方法,临床DNA分析,其次是深度测序。

“从我们的经验中,液滴数字PCR (ddPCR)是最敏感和最快的测试为研究体细胞突变,在组织或液体活检,当你需要分析几个已知的突变,“Casali-da-Rocha说。“我们可以准确、快速和高灵敏度分析循环游离DNA,以较低的成本。我们发现它使一个更好的替代方法定期检测重要生物标记和基因变异与非小细胞肺癌(NSCLC),可以帮助确定这些患者的靶向治疗。”

Casali-da-Rocha和他的团队分析了38晚期非小细胞肺癌患者,服用液体活检样本来自各种来源和执行ddPCR化验检测基因的改变。[v]“我们ddPCR用于液体活检的表皮生长因子受体突变,包括像T790M耐药突变,“Casali-da-Rocha解释道。ddPCR化验可供大量热点跨几个可行的基因改变驱动非小细胞肺癌的进展,包括表皮生长因子受体(突变),碱性(融合、突变),ROS1(融合),BRAF(突变)和喀斯特(突变)。“我们能够识别有意义的基因改变在许多病人,结果果断的指示或者靶向治疗的改变。”

展望未来,Casali-da-Rocha指出,近端液体活检可能是一个不错的选择对于中枢神经系统的分析,尿液、唾液、精子及其他体液提取病人。至于他的研究所的计划实现ddPCR-based液体活检,Casali-da-Rocha说,“我们想介绍液体活检在诊断水平,手术前或任何治疗,因此突变标记可以更好的基线水平相比。”

小说多重PCR检测识别酵母种类

实时PCR是一种行之有效的分析方法在医学微生物学,特别是对病毒和细菌感染。然而,应用程序的实时PCR在医学真菌学仍具有挑战性。

Amir Arastehfar博士生Westerdijk真菌生物多样性研究所荷兰乌特勒支,即将结束他的博士研究酵母的物种,其中包括等等。在他的研究工作与π,博士Teun BoekhoutArastehfar着手开发PCR分析,可以确定最普遍和重要的酵母物种造成感染人类。“由于低数量的循环和真菌细胞细胞壁的刚性,使用PCR是有问题的,因为它需要一个广泛和有效的DNA提取协议,“Arastehfar解释道。“因此,一些社区,如bet188真人真菌PCR倡议(FPCRI)建立了改善从临床中提取DNA样本和设计敏感和特定的实时PCR化验。”

虽然文化是金本位制技术在医学真菌学,它没有足够的灵敏度,根据Arastehfar。“例如,可能会有“真菌细胞循环不被文化,但容易捕获和检测到实时PCR,”他指出。

Arastehfar Boekhout特别感兴趣的是建立一个负担得起的和可靠的测试方法,可以部署在发展中国家,没有(或限制)访问敏感的检测手段,如MALDI-TOF质谱或Sanger测序。“世界卫生组织建议PCR作为发展中国家的一个好的替代方法,“Arastehfar说。“我们的PCR更为具体,敏感,和快速的表型分析识别相比,需要一系列的实验,几乎把48 - 72小时。”

伊朗和荷兰科学家的酵母板复合PCR鉴定21目标物种yeast-driven感染的(占95%)在三个复合PCR反应。(vi)第一个PCR反应识别最普遍假丝酵母物种,包括耐多药的物种,假丝酵母耳。如果一个隔离没有确定在第一个PCR反应,它可以接受第二个PCR反应识别日益减少假丝酵母物种。隔离-识别使用第一个和第二个PCR反应然后应用到第三个PCR反应,主要是识别basidiomycetous酵母种类。(图。1)“每个PCR反应中的每个物种都有一个特定的长度并确定凝胶电泳上应用时,可微的其他物种,”Arastehfar指出。

他补充说,这种方法可以缩短周转时间从48 - 72小时到几个小时,节省了巨大的成本相关的生化指标,并允许报告对发展中国家更可靠的流行病学数据。

图1所示。 酵母面板的工作流。一)所使用的识别策略。如果第一个多路复用PCR是负的,酵母殖民地受到第二复合PCR。如果结果从第二复合PCR是负的,第三个多重PCR。如果第三个多重PCR是负的,这可能是另一个酵母物种不受这个多重PCR测试。B) 2 - 3小殖民地与PCR反应混合液混合运行PCR程序紧随其后。结果可视化的凝胶,条带模式与相应的控制。( 资料来源:诊断微生物学和传染病,2019年 )

未来的前景在医学真菌学PCR

虽然目前研究世界目睹传染病的流行病学酵母种类的变化,实时PCR在医学真菌学的应用仍处于起步阶段。

Arastehfar Boekhout希望,在不久的将来,高效的DNA提取方法和高度敏感和特定的实时PCR检测将加速。“我们建立了其他多重PCR检测补充酵母面板多重PCR,“Boekhout总结道。“在不久的将来,我们将评估与临床疗效的PCR获得血培养,尿液和活检。我们相信,高度的特异性和敏感性的PCR阳性血培养应用将有助于选择合适的抗真菌药物,降低死亡率。”

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