液相色谱法-包括HPLC, UHPLC和LCxLC

什么是液相色谱法?

液相色谱(LC)是一种色谱技术用于分离和分析溶液中化学成分的混合物，以确定某种特定成分是否存在，如果存在，则有多少。我们中的许多人都熟悉一种平面LC的形式，从我们的学生时代，在滤纸上做一个黑色的墨水标记，将一端浸入水中，然后 观察油墨内的成分颜色分离出来 水把纸浸湿了。然而，在分析应用中使用的大部分LC是基于柱层析的，这将是本文的重点。高效液相色谱(HPLC)，顾名思义，是用于高效分离的高性能变体，具有高色谱分辨率。分离的组分也可以在检测后被分离，作为一种纯化手段，使用馏分收集器。高效液相色谱法有多种不同的配置，用于分离分子量从半挥发性小分子到数万千道吨的大蛋白质生物分子不等的溶解成分。

液相色谱法是一种非常流行的分析技术，用于许多应用，包括但不限于:

• 环境监测
• 饮用水分析
• 食品安全和质量控制
• 空气质量分析
• 化工检测
• 临床诊断包括新生儿筛查
• 制药和生物制药分析
• 检查滥用药物

液相色谱法是如何工作的?

各种不同的系统配置可用于液相色谱仪，具有最高效率的分离运行超高高效液相色谱法(UHPLC)仪器，该技术在2004年首次商业化，并被称为超高效液相色谱法(UPLC)。简而言之，由于单个组分在流动相(图1(1))和固定相(柱)(图1(3))之间的独特划分，可溶于液体流动相的多组分混合物被分离。

流动相，通常是溶剂，在高压泵的帮助下将样品输送到系统中(图1(1))。然而，它在分离过程中也起着关键作用。

少量样品(1-100 μ L)装入样品回路(图1(2))，然后通过六口阀注入流动相流，这触发色谱运行的开始。一旦样品被注入，流动相被泵入柱中(图1(3))。有多种柱长(30 ~ 250 mm)和内径(1 ~ 4.6 mm)可供选择，填充有不同活性和粒径(1.5 ~ 10微米直径)的固定相吸附材料，共同决定了柱的效率和选择性。所述柱位于柱炉内;在较高的温度(45ºC)下，流动相的粘度降低，其线速度增加。这反过来减少了运行时间，也提高了色谱分辨率。

混合物中与流动相亲和度较高的组分将快速通过色谱柱迁移，与固定相的相互作用很小。当组分的带离开或洗脱柱时，检测器(图1(4))将给出与组分浓度成正比的响应。从注射到检测的时间称为保留时间。对于一组给定的色谱条件，某一组分的保留时间是非常具体的，并可与鉴别标准的保留时间进行比较。

在反相色谱的情况下，极性较低的分析物将优先划分为非极性固定相，并具有较长的保留时间。的数据采集系统(图1(5))将检测器响应记录为色谱图中保留时间的函数。在色谱图中记录的峰(图2)通常是积分，以确定峰面积，它与样品中存在的成分的浓度成正比。

图1: 液相色谱仪连接质谱仪(LC-MS)的简化图，显示:(1)用于流动相的二元泵，(2)自动进样器6口阀和注入器回路，(3)带柱式柱式加热器，(4)质谱仪检测器，(5)PC机。来源:Anthias Consulting。

自动进样器将样品注入流动相后，分离过程在色谱柱中进行。色谱系统的选择性对色谱分辨率影响最大，应针对所研究的应用和组分进行定制。可通过改变流动相(不同溶剂)的脱致强度或固定相中存在的特定化学官能团(改变柱型)来改变选择性。

图2 : HPLC或LC-MS输出的色谱图。来源:Anthias Consulting

考虑到流动相，在运行液相色谱仪时有两种主要的操作模式可供选择，即等距或梯度。等距法将在色谱运行期间使用相同的流动相组成，而选择性没有变化。梯度法可以使流动相组成随时间的变化而变化，这通常被优化为增加色谱分辨率或缩短运行时间。

固定在色谱柱内的固定相的化学性质影响该技术的选择性。反相HPLC或UHPLC¹是最流行的系统配置，并采用非极性固定相，如十八烷基硅烷(ODS或C18)和极性流动相(水/甲醇)。其他反相固定相包括辛烷(C8)，它比C18疏水少，对极性较低的分析物保留时间相应较短。如果使用带有酚取代基的功能化柱，这将增加酚类成分的保留，因为它们的亲和力增加;同类相吸。

流动相的pH值对离子组分的保留时间有深远的影响，这应该在方法开发过程中加以利用。缓冲区²可用于维持流动相的pH值低于pKA的离子组分，它反过来把它的解离平衡转变为中性形式。中性形式的组件极性较小，因此其保留时间可以控制。

正相色谱法是另一种基于极性分离分析物的LC方法，实际上是在反相液相色谱法引入之前开发的，但不太流行。在正常的相色谱中，固定相是极性的^3.流动相是非极性的。这改变了系统的保留特性，混合物的非极性组分首先洗脱，保留时间最短。极性分析物对固定相具有较高的亲和力，洗脱时间较晚，保留时间较长。还有其他类型的液相色谱，包括离子色谱法,包括离子交换而且离子对大小排斥、亲和性等等。除了尺寸排除色谱，它根据分析物的大小/形状或分子量分离，其他形式的LC都采用不同的流动和固定相化学。对一组给定的待分离组分所能达到的选择性和色谱分辨率由所使用的固定相和流动相决定。

这些成分一旦分离，就需要检测。的选择探测器由应用程序的方法目标驱动;有多种选择，具有不同程度的敏感性，特异性，选择性和线性动态范围。最流行的检测器是可见-紫外可见)测量特定波长光吸收的探测器。波长是根据要分析的成分的lambda max选择的，探测器响应与该特定成分的浓度成正比。当组分从色谱柱上洗脱时，其在检测器流单元内的浓度会上升和下降，这反过来被绘制为色谱峰(见图2)。数据采集速率应设置为在整个峰上采集至少20个数据点。与许多色谱技术一样，质谱系统的连字符通常提供最佳的分析分辨率和广泛的可用选项。

用于连接LC系统各个组件的油管的长度和内径是至关重要的，应该保持在绝对最小值。色谱系统的任何部分，从注射回路的开始到检测器流池的结束，都不是固定相，对有效分离没有贡献。系统中这个额外的体积被称为空隙体积，空隙中分离组分的额外纵向扩散将导致灵敏度的损失和色谱分辨率的降低。

UHPLC由HPLC演变而来

UHPLC的发展部分是由于分析人员对越来越复杂和具有挑战性的样品的更高分辨率分离的要求不断增加。使色谱性能发生这一阶跃变化的主要突破是亚2微米固定相包装材料的开发⁴具有较窄的粒径分布。

新颗粒的制造具有与常用HPLC固定相相同的化学功能，这确保了在使用相同的流动相时保持色谱系统的选择性。当使用新的亚2微米包装材料时，提高了效率或板数，从而实现了显著的性能优势。

将HPLC方法迁移到UHPLC系统中有许多优点，包括更短的运行时间，更高的色谱分辨率，更高的灵敏度和更少的溶剂消耗。为了使用新型UHPLC色谱柱，必须使用可以在更高压力下运行的泵，以适应柱中较小颗粒施加的背压增加。检测器流单元还需要升级，以具有更小的内部体积，这对于检测从色谱柱洗脱的组分的窄带是必要的。数据采集速率也需要相应提高，以确保峰间有足够的数据点。

质谱与液相色谱的连字符(质）

质谱分析可以说是最好的检测器，可以连接到液相色谱仪由于其高灵敏度，线性动态范围，选择性，甚至特异性时，使用仪器具有非常高的质量分辨率。质谱技术用于测定质荷比(m / z)的成分或分析物。与气相色谱-质谱(GC-MS)不同，LC系统与质谱的结合并不容易，需要多年的发展。电喷雾电离(ESI)是当今LC-MS中最常用的电离技术，其电离过程发生在大气压下。在质谱分析系统中，很难实现所需的高真空大气压入口的开发。微流而且低流量LC-MS在生物标志物检测和生物制药分析等领域被证明是有用的。

你如何读LC-MS质谱，它告诉你什么?

电喷雾电离是一种非常软的电离技术，这意味着在离子形成过程中观察到的碎片非常少。LC-MS系统可以在正离子模式下运行，用于产生质子化分子的基本分析物[M+H]⁺，或负离子模式的酸性分析物产生去质子化分子[M-H]^-．

这是可能的碎片离子由电喷雾过程产生，通常通过碰撞诱导解离(CID)，以获得更多的信息来表征或识别目标分析物。CID可以在离子源中通过改变应用于第一个采样或撇油锥的电位差来进行，或者在碰撞电池中，离子被加速成碰撞气体，如氩气。

图3是全扫描LC-MS采集，源内碰撞诱导解离，为混合物的每个分离组分产生一系列特征片段离子。质量电荷比(m/z)沿x轴绘制，离子的强度或相对丰度沿y轴绘制。图3中的z轴表示分离组分的保留时间，每个基线分辨色谱峰由质谱仪一次分析一个，关键诊断片段离子可用于鉴定和目标离子确认。

图3: 一系列全扫描LC-MS质谱，增加了MS额外维度的信息。来源:Anthias Consulting。

将液相色谱法引入多维度

当处理复杂的多组分混合物时，可能不可能将每个组分作为洗脱柱的单个峰进行基线解析。方法开发和优化只能到此为止，如果由于缺乏选择性而无法获得色谱分辨率，则可能需要使用具有替代选择性的附加色谱柱来分离共洗脱组分。

多维色谱法⁵使共洗脱组分通过“心切”转移到具有更合适选择性的替代色谱柱上，可以将分离分解为单独的洗脱组分。该系统可以设置一个分流阀，简单地将第一维或柱中检测后的共洗脱峰转移到第二维，以便后续的分离和检测具有更高的色谱分辨率。多维LC的改进功能已被证明在许多领域有用，包括foodomics，食品安全及可追溯性．

半制备液相色谱纯化

通过扩大液相色谱系统的尺寸，使用内径更大、流速更高的色谱柱，可以在色谱柱上装载更多的物质。Semi-preparative色谱法⁶系统可以装载100毫克的样品。然后使用馏分收集器将色谱峰收集到单独的小瓶中，因为它们从柱上洗脱。分数收集器由检测器触发，检测器在色谱基线中寻找指示峰开始的拐点，并将分离组分的峰作为纯分数收集。然后，分离出的组分可以进行额外的分析技术，以补充质谱，如核磁共振(NMR)，以便充分表征化合物的结构阐明。

液相色谱法的优点和局限性

LC通常用于各种各样的应用;但不适用于挥发性化合物的分离和分析。只有当所有待分离组分的蒸汽压都低于流动相时，才能实现稳健的LC分析方法。气相色谱法更适合于分析挥发性化合物。一些生物制药的性质已被证明对LC分析具有挑战性。然而,设备和技术的进步正在帮助克服这些问题。

大量不同的色谱柱和溶剂可提供巨大的选择性范围，使具有广泛极性的组分得以分离。大分子和小分子同样适用于这种技术。在相对较低的温度下进行高效分离的能力也使LC成为热不稳定化合物的理想分离技术，这些化合物可能在气相色谱仪中分解。

液相色谱的常见问题

样品制备是关键成功；在将所有样品装入自动采样器之前，对它们进行过滤是非常重要的。这在使用UHPLC工作时尤其重要，在柱中使用亚2微米颗粒进行高效分离时，如果样品未经过过滤，很容易阻塞。移动阶段也是如此，特别是当使用缓冲区时。

对样品使用正确的注射或稀释溶剂是至关重要的，溶剂的强度应等于或小于流动相的启动条件。如果使用的溶剂太浓，则会观察到峰分裂和再现性差。如果在自动采样器中使用过强的洗涤溶剂，可能会观察到类似的问题。

所获得的色谱图基线波动或保留时间再现性差很可能是由于泵(图1(1))或真空脱气器的问题造成的。如果泵或真空除气器没有得到很好的维护，止回阀可能会部分卡住，从而导致压力波动。这些问题可以通过按照制造商指南执行预防性维护任务来解决，以防止计划外停机和性能不佳。色谱图可以提供关于信用证问题的线索．

参考文献

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